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각막이상증 유전질환을 가진 가계의 일반적 결실 다형성의 유전적 연관성 분석
  • 작성일2009-12-25
  • 최종수정일2012-08-25
  • 담당부서감염병감시과
  • 연락처043-719-7173

 

 각막이상증 유전질환을 가진 가계의 일반적 결실 다형성의 유전적 연관성 분석


Genetic association analysis of common deletion polymorphism in Avellino corneal dystrophy families

     


질병관리본부 국립보건연구원 유전체센터 형질연구과      


Ⅰ. 들어가는 말
  과립형 각막이상증 2형(Granular corneal dystrophy type 2 ; 이하 GCD2)은 흔히 아벨리노 각막  이상증(Avellino corneal dystrophy)1)으로 잘 알려져 있는 유전성 각막질환으로 상염색체 우성의 유전양상을 보인다[1]. 5번 염색체의 단완에 위치한 TGFBI(TGF β-induced gene human locus 3) 유전자의 124번째 아미노산 돌연변이(R124H)에 의해 질환이 유발되며, 이형접합자(hetero-zygote)와 동형접합자(homozygote) 사이에 증상의 차이가 있다[2]. 동형접합자(Figure 1)는 약 3세부터 증상이 나타나서 6세 경에는 급격한 시력저하를 보이며, 엑시머 레이저를 이용한 치료레이저각막절제술(phototherapeutic keratectomy ; PTK), 각막이식술을 시행하여도 재발하는 난치성 질환이다. 이형 접합자의 경우 약 12세부터 각막간질에 흰 점이 생기기 시작하여, 나이가 들어감에 따라 흰 점의 숫자와 각 점의 면적이 넓어져 결국 시력 장애가 유발된다.
  TGF-β는 GCD2의 원인 유전자인 TGFBI의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. GCD2 환자가 눈을 찡그려도 햇빛에 노출되는 부위에서 흰 백질(TGFBIp)의 침적이 가장 먼저 발생하는 사실로 볼 때[3], 햇빛의 자외선으로 인해 GCD2의 증상이 악화된다는 것을 추정해 볼 수 있다. 대기를 통한 자외선 피폭과 근시굴절 교정수술의 증가 등으로 인해 각막 혼탁이 급격히 진행되는 사례가 급증하고 있으며, 평균수명이 증가함에 따라 각막 혼탁의 진행으로 인한 시야 장애를 호소하는 환자도 점점 늘어나고 있는 추세이다.
                                    
  지금까지 GCD2의 원인 유전자로 알려진 TGFBI와 그 단백질은 우리 몸에서 피부, 연골, 그리고 상처 받은 각막에 많다는 것 이외에는 연구가 많이 되어 있지 않았다. 동일한 유전변이를 가진 환자들 사이에서 증상의 차이가 관찰됨에도 불구하고 이와 관련된 유전인자에 대한 보고는 아직까지 없었으며, 따라서 증상의 경중과 관련된 유전 및 환경인자를 발굴하고 이들 간의 상호작용에 관해 연구할 필요가 있다.
  CNV(Copy Number Variation)에 대한 연구는 Boveri 등이 염색체 이상(chromosome abnormality)에 의해 암이 발생한다고 보고한 이후 주목받기 시작했으며, 1950년대 다운증후군 등이 발견되면서 세포유전학(cytogenetics)이 하나의 학문 분야로 태동한 이래 연구가 꾸준히 진행되어 오다가 최근에는 질병관련 연구의 핵심으로 자리잡고 있다. CNV란, 염색체상에서 1kb 이상의 복제(duplication), 삭제(deletion), 전위(inversion), 그리고 전좌(translocation) 등이 일어난 사건을 의미한다. 참조염색체(reference genome)와 비교하여 상대적으로 다양한 크기의 CNV가 지놈(genome)상에 존재하고, 동일 부위라도 개인 간에 매우 다양한 크기로 존재한다. CNV는 암 세포에서 염색체 이상으로 발생하는 재조합과는 다르며, 일반적으로 정상인이 태어날 때부터 부모로부터 유전되어 가지고 있다. 그러나 유전되지 않고 산발적으로 발생하는 CNV도 존재하며 질병을 일으키는 인자로 보고되고 있다. 최근 CNV를 연구하기 위한 대용량 array 등이 속속 개발되고 있으며, 그동안 질환과 관련된 유전적 소인을 중심으로  수행된 SNPs(Single Nucleotide Polymorphisms) 연구와 더불어 향후 질병 관련 연구에서 중요한   분야로서 집중적인 연구가 수행될 것으로 예상된다.
  현행의 유전자형(genotype) 정보를 이용한 전통적 유전 통계학적 방법으로 유전자의 결실부분을 찾아내기란 어려운 일이다. 부모에게서 자식으로 유전된 단일염기서열 유전자형(SNP genotype)의 복제   또는 삭제 정보는 전통적 유전 통계학적 방법을 이용한 분석에서 종종 맨델리안 유전법칙을 위배하는 것으로 간주하게 된다[4]. CNV 연구는 이러한 잘못된 분석 결과를 보완할 수 있으며, 특히 결실에   대한 CNV 연구는 여러 가지 방법으로 증명되었는데 이중 Conrad 등은 비맨델리안 유전을 이용하여 586개의 잠정적인 결실을 밝혀냈고[4], McCarroll 등은 트리오(trios;부모와 자녀) 분석을 통해 541개의 결실을 밝혀내었다[5]. 또한 위와 같은 적용이 유전적 결실을 찾아낼 수 있는 유일한 방법이 되었다.
  본 글에서는 CNV 구역에 존재하는 작은 삭제 다양성(deletion variants)을 분석할 수 있는 새로운  방법을 소개하고자 한다. 동아시아 이민자 코호트와 각막이상증 질환 가계 코호트로부터 총 404개의  트리오 분석을 통해 1,029개의 삭제 다양성을 발굴하였으며, GCD2 환자-대조군 연관성 분석을 통해 밝혀진 가장 유의한 변이(variants) 10개에 대해서는 real-time PCR 분석을 통해 확인하였다.


Ⅱ. 몸 말
  각막이상증 가계 시료 551개 및 동아시아 이민자 코호트554명 등 총 1,105명의 시료를 대상으로 Illumina 370K-Duo SNP chip을 이용하여 유전자형 분석을 실시한 결과, 1,105개의 시료를 모두 성공적으로 분석하였다.
  SNP 성공률은 각막이상증 가계 시료 551개 중 98.49%, 동아시아 이민자 코호트 554명 중 98.33%로 나타나 chip에 디자인되어 있는 SNP 대부분을 유전자형 분석하는데 성공하였다. 551명의 각막이상증 가계로부터 341,577개의 SNPs와 554명의 동아시아 이민자 코호트로부터 얻어진 341,039개의 SNPs 정보를 이용하여 유전적으로 오류를 가지는 표지자(marker)를 먼저 발굴하였고 그 중 5 트리오(1%)  이상에서 공통적으로 오류를 가지는 SNP 표지자를 발굴한 결과 1,450개로 나타났다. 다시 Illumina사의 BeadStudio software를 이용하여 정확히 결실로 판단되어지는 표지자들만 뽑아낸 1,029개를 최종   일반적 결실 다형성 표지자로서 분류하였다.
  각 염색체에서 나타난 결실 다형성은 Figure 2에 나타냈다. 대부분의 표지자들은 6번 염색체에 분포되어 있고 21번 염색체가 가장 적은 표지자를 나타냈다(Figure 2(A)). 그 중 13개의 결실 다형성은 coding region(1.3%)에서, 290개는 intron region(28.2%)에서, 388개는 flanking-3’UTR region(37.7%), 329개는 flanking-5’UTR region(32.0%)에서, 9개는 UTR(0.9%)에서 발굴되었다(Figure 2(B)).
                                    
  결실 다형성 중 449개(44%)는 데이타베이스에 존재하였고 580개(56%)는 새로운 것이 발굴되었다. 각각의 결실다형성을 이용하여 PBAT module2)을 가진 HelixTree 프로그램을 이용한 가족연관성 분석을 실시하였다[6]. 연관성 분석은 각막이상증을 지닌 가족구성원과 정상인 가족구성원으로 실시하였다.   그 결과, 6번 염색체의 major histocompatibility complex(MHC) class I F(HLA-F) 주변이 가장 유의미한 값을 나타내어 각막이상증과 연관성이 높은 것으로 나타났다(P=0.0003). 이 결실 다형성은 각막이상증에 연관을 가지는 유전자로 사료된다. 이 결실다형성을 갖는 rs885945는 시료 숫자가 적기 때문에 Bonferroni's correction을 정확히 적용시킬 수 없었다.
  이렇게 발굴된 결실 다형성 주변에 실제 CNV가 존재하는지를 증명하기 위해 qPCR을 이용하였으며, 나타나는 복제수는 0, 1과 2로 나타냈다.
  Figure 3의 왼쪽 BeadStudio 3.2 프로그램의 클러스터 이미지를 보면 rs885945의 결실 다형성은 모두 6개의 유전자형들로 나뉜다. 이것을 오른쪽 qPCR의 결과와 비교해보면 대립유전자의 한쪽만 존재하는(A/- 또는 B/-) 다형성에 비해 A/A, A/B 와 B/B는 그의 2배에 해당하는 값이 나왔고 유전자형이 -/-로 나타난 시료는 어떠한 값도 가지지 않는 것으로 나타났다.
 
  다음으로 결실 다형성의 복제수를 주변의 SNPs에 의해 알 수 있는지를 조사해보기 위해 결실 다형성의 haplotype SNPs를 이용하여 10개의 결실 다형성 주변의 SNPs와 LD(linkage disequilibrium)를 확인한 결과, 각막이상증 환자와 동아시아 이민자 코호트에서 10개 중 4개에서 유의미한 LD를 확인하였다(Figure 4). 이로 인해 결실다형성은 주변의 SNPs와 비슷한 진화적인 과정을 거쳤을 것으로 보며 결실다형성 또한 이웃의 SNPs에 의해 알 수 있는 것으로 나타났다.
 
  결실 다형성 rs885945 주변의 CNV는 통계적으로 유의한 각막이상증의 결손 표지자라고 할 수 있다. 500 Kb window에서 살펴보면 HLA-F는 rs885945의 가장 가까운 유전자이다. 그러므로 결실 다형성은 HLA-F의 기능에 중요한 역할을 담당할 것으로 보인다. 이는 HLA-F 내의 SNPs와 rs885945의 높은 LD를 통해서 더욱 뒷받침된다(Figure 5).
                                       

Ⅲ. 맺는 말


  CNV란, 1kb 이상의 복제(duplication) 혹은 삭제(deletion)가 이루어진 분절(segment)이며, 암 세포에서 염색체 이상으로 발생하는 재조합과는 다르고, 일반 정상인도 태어날 때부터 부모로부터 유전되어 가지고 있지만 유전되지 않고 산발적으로 발생하는 CNV도 존재하며 질병을 일으키는 인자로 보고됨에 따라 최근까지 CNV의 질병 관련성 연구가 활발하게 진행 중에 있다. 이 연구에서 저자는 CNV region의 SNP 유전자형에서 결실을 발굴할 수 있는 방법을 개발하였다. 하지만 결실이 아닌 획득의 경우에는  이러한 방법으로 발굴할 수 없는 단점이 있다. 이러한 단점에도 불구하고 결실 다형성의 정보는 정확한 SNP 유전자형을 갖는 CNV region을 발굴할 수 있도록 해 주고 CNV 연관분석 연구를 가능하게 하였다.
  TGFBI 단백질(TGFBIp)은 extracellular matrix 단백질로 세포 분화, 부착에 관여하는 non-leukocytes에 의해 분비되며, TGFBI의 mRNA는 림프조직에서 가장 많이 발견되고 면역 조절에 관여하는 비성숙(immature) 수지세포에서도 TGFBI 단백질 분비가 관찰되므로 TGFBI가 면역 조절   과정에서 역할을 담당하는 것으로 추정된다. 이번 연구에서 1,029개의 결실다형성 중, rs885945는   각막이상증 가족시료에서 그 질병과 가장 유의한 연관을 나타냈다. 비록 rs885945가 HLA-F coding region에 존재하지는 않지만 HLA-F내에 존재하는 다른 SNP와 높은 LD(linkage disequilibrium)를 형성하였다. HLA-F가 면역세포의 활성화와 관계가 있다고 보고된 바는 있으나 아직 명료하게 밝혀진  기능은 없다. 그러나 이런 결실 다형성은 HLA-F 기능에 중요한 역할을 할 것으로 보며 이 유전자가 과립형 각막이상증 2형과 관련되어 있을 것으로 추정된다.


Ⅳ. 참고문헌

 1. Rosenwasser, G.O. Sucheski, B.M. Rosa, N. Pastena, B. Sebastiani, A. Sassani, J.W. Perry, H.D. Phenotypic variation in combined granular-lattice
     (Avellino) corneal dystrophy. Arch Ophthalmol 111, 1546-1552 (1993).
 2. Tsujikawa, K. Tsujikawa, M. Watanabe, H. Maeda, N. Inoue, Y. Fujikado, T. Tano, Y. Allelic homogeneity in Avellino corneal dystrophy due to a founder
     effect. J Hum Genet 52, 92-97 (2007).
 3. Folberg, R. Alfonso, E. Croxatto, J.O. Driezen, N.G. Panjwani, N. Laibson, P.R.  Boruchoff, S.A. Baum, J. Malbran, E.S. Fernandez-Meijide, R. Clinically
     atypical granular corneal dystrophy with pathologic features of lattice-like amyloid deposits. Ophthalmology 95, 46-51 (1988).
 4. Conrad, D.F. et al. A high-resolution survey of deletion polymorphism in the human genome. Nat Genet 38, 75-81 (2006).
 5. McCarroll, S.A. et al. Common deletion polymorphisms in the human genome. Nat Genet 38, 86-92 (2006).
 6. Lange, C. DeMeo, D. Silverman, E.K. Weiss, S.T. Laird, N.M. PBAT: tools for family-based association studies. Am J Hum Genet 74, 367-369 (2004).


 
 

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