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국내 유행 인플루엔자 항바이러스제 내성 분석, 2008.8-2009.12
  • 작성일2010-01-29
  • 최종수정일2012-08-25
  • 담당부서감염병감시과
  • 연락처043-719-7173

 

 국내 유행 인플루엔자 항바이러스제 내성 분석, 2008.8-2009.12
Antiviral drugs resistance of influenza viruses isolated in Korea during 2008.8-2009.12

     
질병관리본부 국립보건연구원 감염병센터 인플루엔자바이러스과     
    


Ⅰ. 들어가는 말
  인플루엔자는 짧은 잠복기와 높은 전염력, 그리고 표면항원인 hemagglutinin(HA)과 neuraminidase(NA)의 변화에 따른 항원변이로 인해 해마다 크고 작은 유행을 일으키는 호흡기 감염질환으로 특히, 노약자나 만성 질환자에서는 폐렴 등 합병증으로 인한 입원, 사망률 증가를 초래할 수 있다.
  인플루엔자 예방의 가장 효과적인 방법은 매년 인플루엔자 백신을 접종하는 것이다. 그러나 인플루엔자 바이러스의 항원변이로 인하여 이미 만들어진 백신주와 실제 유행주가 달라질 경우에는 백신 효능이 떨어질 수 있고 생산과정의 문제로 공급이 제한되는 경우도 있다.
  인플루엔자 항바이러스제는 발증 초기에 사용할 경우 증상을 완화시키고 발열 기간을 단축하는 등 효과적인 환자 관리 수단이 된다. 그러나 최근 항바이러스제 사용 빈도가 증가함에 따라 약제 내성 바이러스의 분리빈도가 증가하고 있는데, 특히, 2008년 1월 노르웨이에서 oseltamivir에 내성을 가진 계절 인플루엔자 A(H1N1)형 바이러스 분리가 보고된 이후 유럽, 미주, 서태평양 지역에서도 분리빈도가 급증하였다[1]. 2009년 4월 이후 현재까지 계속 문제가 되고 있는 신종 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스에서도 내성주 발생이 계속  보고되고 있다[2].
  질병관리본부 인플루엔자바이러스과는 2002년부터 인플루엔자 항바이러스제 중 M2 억제제인 amantadine과 neuraminidase(NA) 억제제인 oseltamivir 및 zanamivir에 대한 내성 감시체계를 운영하여 국내 인플루엔자 바이러스 분리주에서의 약제 내성 양상을 모니터링하고 있다. 이 글은 2008-2009 절기 동안 국내에서 유행한 계절 인플루엔자바이러스 및 2009년 5월 이후 분리된 신종 인플루엔자바이러스의 항바이러스제 내성주 발생 양상을 분석한 결과를 보고하고자 한다.
                                       


Ⅱ. 몸 말

   국내 유행 인플루엔자 바이러스에 대한 약제 내성 양상은 2008-2009 절기(2008년 8월 31일-2009년 8월 29일) 동안 분리된 계절 인플루엔자 바이러스 및 2009년 18주부터 50주까지(2009년 5월 1일-2009년 12월 9일) 국내에서 확인된 신종 인플루엔자 바이러스를 대상으로 조사하였다. 국내 분리주의 선정은 통계적으로 유의한 자료를 확보하고자 주별, 지역별, 아형별 무작위 표본 추출법을 적용하여 총 834주[A(H1N1) 534주, A(H3N2) 287주, B 13주]의 계절 인플루엔자 바이러스 및 총 810주의 신종인플루엔자 바이러스를 선정한 후 M2 억제제(amantadine) 및 NA 억제제(oseltamivir 및 zanamivir)에 대한 내성 양상을 분석하였다. 계절 및 신종 인플루엔자 A형 바이러스 총 1,631주[A(H1N1) 534주, A(H1N1)pdm 810주, A(H3N2) 287주]에 대해서는 M2 억제제 및 NA 억제제에 대한 내성 양상을 분석하였고, 인플루엔자 B형 바이러스 13주에 대해서는 NA 억제제 내성 양상만을 조사하였다(Table 1). 
 
  이 연구에서 이용된 Madin-Darby Canine Kidney(MDCK) 세포는 10% 우태아혈청(FBS)과 항생제(100U/ml penicillin-streptomycin)가 첨가된 Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다.
  단층 배양된 MDCK 세포에 트립신(trypsin)이 첨가된 배지를 이용하여 인플루엔자 바이러스 분리주를 접종한 후 5% CO2, 35℃ 조건에서 배양하여 80% 정도 이상의 세포병변효과(cytopathic effect; CPE)가 관찰되면, 이를 수확하여 원심분리(4℃, 10,000 rpm, 15min)하였으며 상층액과 세포침전물을 분리한 후 -70℃에 보관하면서 사용하였다.
  현재 사용되고 있는 인플루엔자 항바이러스제 종류로는 M2 억제제인 amantadine과 rimantadine, 그리고 NA 억제제인 oseltamivir와 zanamivir가 있다(Table 2). Amantadine과 rimantadine은 화학구조가 유사한 약제로 A형 인플루엔자 바이러스에만 특이적으로 작용한다. 국내에서는 현재 amantadine이 시판되고 있어 본 실험에는 Amantadine hydrochloride(Sigma, USA) 제품을 사용하였다.
                                          
  NA 억제제인 oseltamivir와 zanamivir는 A형과 B형 인플루엔자바이러스 모두에 대해 억제 효과가 있으며, zanamivir가 2000년 4월 식품의약품안전청으로부터 허가를 받아 동년 9월부터 국내에서 시판되었으며, oseltamivir는 1년 후인 2001년 11월부터 발매가 시작되었다. 본 실험에는 oseltamivir carboxylate(Roche, Switzerland)와 zanamivir(GlaxoSmithKline, UK)를 각 생산업체로부터 공급받아 사용하였다.
  인플루엔자 항바이러스제 내성은 표현형 분석법(phenotypic assay)과 유전형 분석법(genotypic assay)을 이용하였다.
  M2 억제제에 대한 표현형 분석법의 경우, 항바이러스제를 농도별(0, 1, 10 ㎍/㎖)로 세포에 전처리한 후 37℃, 5% CO2로 유지된 배양기에서 30분간 배양하였다. 플레이트 24개 웰 각각에 104-5 TCID50의 인플루엔자바이러스를 100㎕씩 접종한 후 0, 1, 10㎍/㎖의 농도로 제조된 amantadine을 접종용 배지에 넣어 35℃, 5% CO2로 유지된 배양기에서 24시간 배양하였다. 이후 세포 상층액에서 혈구응집반응(haemagglu-tination assay)을 이용하여 역가를 측정하여 약제 처리에 따른 바이러스 증식 억제 정도를 확인하였다.
  Neuraminidase 억제제에 대한 표현형 분석을 위해서는 세계보건기구 협력센터인 호주 인플루엔자 표준실험실(WHO Colla-borating Centre for Reference and Research on Influenza)에서 제공하는 표준 실험법인 형광 neuraminidase 억제법(Fluoro-metric Neuraminidase Inhibition Assay, WHO-025)을 사용하였다. NA 억제제의 농도가 0-30,000nM 되도록 준비하여 50㎕씩을 플레이트 96개 웰 각 행에 넣고 각 웰에 인플루엔자바이러스를 50㎕씩 그리고 마지막 웰은 대조로 asssay buffer 용액 50㎕를 첨가한 후 상온에서 45분간 반응시켰다. MUNANA(methyl umbelliferone N-acetyl neuraminic acid) 기질을 50㎕씩 각 웰에 첨가한 후 37℃에서 1시간 반응시킨 다음, 100㎕의 반응 정지액을 첨가한 후 355nm와 460nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. Prism 4.0 프로그램을 이용하여 각각의 바이러스에 대한 NA 억제제 IC50를 구한 후, IC50 농도가 호주 인플루엔자 표준실험실에서 제시한 Table 3의 범위에 속하는 경우는 감수성주로 판정하였으며, IC50 농도가 50-200nM이면 중등 내성이고, >200nM일 경우에는 고도 내성으로 판정하였다.
 
  M2 억제제의 유전형 분석을 위해서는 A형 인플루엔자 바이러스의 M2 유전자 중 amantadine 내성과 관련된 아미노산 변이(L26F, V27A, A30T, S31N, G34E) 부위를 확인하였다. Neuraminidase 억제제에 대해서는 NA 유전자의 염기서열 분석을 통해 내성과 관련있는 아미노산 부위(E119V, R152K, I223V, H274Y 및 R292K 등)에서의 변이 여부를 확인하였다(Table 4).
 
  2008-2009 인플루엔자 절기동안 국내에서 분리 확인된 계절 인플루엔자 A(H1N1)형 바이러스 534주와 A(H3N2)형 바이러스 287주 및  2009년 12월까지의 신종 인플루엔자 A(H1N1)pdm형 바이러스 810주를 대상으로 M2 유전자에 대한 염기서열 분석을 수행하여 내성 관련 부위인 아미노산 26, 27, 30, 31, 34의 변이 여부를 조사한 결과, A(H1N1) 534주 중 12주(2.2%), A(H1N1)pdm 810주 중 810주(100.0%)와 A(H3N2) 287주 중 285주(99.3%)에서 M2 유전자 부위의 내성과 관련된 아미노산 변이가 관찰되었다(Table 5). M2 유전자에서 내성과 관련된 아미노산 L26F, V27A, A30T, S31N, G34E 부위를 관찰한 결과, 아미노산 26, 27, 30, 34에서는 아미노산 변이가 나타나지 않았으며 아미노산 31 부위에서는 내성이 확인된 397주 [A(H1N1) 12주, A(H1N1)pdm 100주, A(H3N2) 285주] 모두에서 Ser이 Asn으로 치환되어 M2 억제제 내성과 관련된 유전적인 변이를 확인하였다.
 
  M2 유전자에 대한 염기서열 분석을 통해 인플루엔자바이러스 분리주에서 M2 억제제 내성과 관련된 유전적인 변이를 확인한 후, 9주의 내성주 및 1주의 감수성주를 대상으로 amantadine 내성의 표현형 결과와 비교하였다. Amantadine 농도별 약제 처리에 따른 바이러스 증식 억제 정도는 haemagglutination(HA) 역가를 측정하여 확인하였다. 그 결과 아미노산 31 부위에서 Ser(S)에서 Asn(N)으로의 변이가 관찰된 내성주는 HA 역가가 거의 변화되지 않아 약제 처리로 인한 바이러스 증식은 영향을 받지 않았다. 반면, 아미노산 31 부위에서 아미노산 변이가 관찰되지 않은 감수성주는 약제 농도별 처리에 따라 바이러스 증식이 억제되어 HA 역가가 감소함을 보여주었다(Table 6). 이 실험을 통해 M2 억제제 내성과 관련된 아미노산 변이(S31N) 결과와 약제 감수성 표현형 결과가 일치함을 확인하였다.
 
  항바이러스제 내성 양상 분석을 실시한 534주의 계절 인플루엔자A(H1N1)형 바이러스, 287주의 A(H3N2)형과 810주의 신종 인플루엔자 A(H1N1)pdm형 바이러스를 대상으로 NA 유전자에 대한 염기서열을 분석하였다. 이들 분리주의 염기서열 및 아미노산 서열 분석을 통해 NA 억제제 내성 관련 부위에서의 변이(E119V, R152K, I223V, H274Y 및 R292K 등) 여부를 조사한 결과, 아미노산 119, 198, 136, 152, 223, 292에서는 아미노산 변이가 나타나지 않았으며, 아미노산 274 부위에서는 내성이 확인된 537주[A(H1N1) 533주, A(H1N1)pdm 4주] 모두에서 His이 Tyr으로 치환되어 NA 억제제 내성과 관련된 유전적인 변이를 확인할 수 있었다(Table 7). 즉, 2008-2009절기 동안 국내에서 유행한 계절 인플루엔자 A(H1N1)형은 NA 억제제에 대해 99.8%의 내성율을 나타내었으며, 2009년 신종 인플루엔자 A(H1N1)pdm형의 경우는 0.5%의 내성율을 보였다. 2009년 신종 인플루엔자 A(H1N1)pdm형에 대한 oseltamivir 내성주는 전세계적으로 109주가 보고되었다(WHO, 2009.12.08).
 
  NA 억제제(oseltamivir 및 zanamivir)에 대한 유전형 분석은 검체 또는 바이러스의 세포 배양액 모두에서 분석이 가능하지만 표현형 분석은 반드시 바이러스의 세포 배양액이 필요하다. 이에, 유전형 분석에 사용된 바이러스 중에서 세포 배양이 확인된 바이러스를 대상으로 표현형 분석을 실시하였다. 항바이러스제에 대한 내성분석을 실시하였던 계절 인플루엔자 바이러스 중 498주[A(H1N1) 405주, A(H3N2) 93주], B형 12주, 2009년 50주까지 신종 인플루엔자 A(H1N1)pdm 24주를 대상으로 인플루엔자 치료제 중 하나인 NA 억제제(oseltamivir 및 zanamivir)에 대한 표현형 분석 방법인 fluorometric NA inhibition assay를 이용하여 50% 억제농도(50% Inhibitory Concentration; 이하 IC50)를 조사하였다. 그 결과, 국내 계절 인플루엔자 A(H1N1)형 바이러스 404주 및 2009년 신종 인플루엔자 A(H1N1)pdm형 바이러스 4주의 oseltamivir에 대한 IC50 값은 107.9-1992.3nM 범위로 나타나 이들 값은 모두 내성주 범위에 속하였다. 반면, zanamivir에 대한 IC50 값은 모두 0.0nM-3.2nM로 이들 값은 모두 감수성주 범위에 속하였다. 또한 2008-2009 절기에 유행한 계절 인플루엔자 바이러스 A(H3N2) 및 B형의 IC50 값은 oseltamivir에 대해서는 0.0nM-2.3nM, zanamivir에 대해서는 0.0nM-6.3nM로 NA 억제제에 모두 감수성을 갖는 것으로 확인되었다(Table 8). 이 실험을 통해 분석된 약제 감수성 표현형 결과는 유전형 분석 방법으로 얻어진 NA 억제제 내성과 관련된 아미노산 변이(H274Y) 결과와 일치하였다.
 


Ⅲ. 맺는 말


  NA 억제제인 oseltamivir와 zanamivir는 amantadine에 비해 내성주 발생 비율이 낮고, A형과 B형 인플루엔자바이러스 모두에 억제 효과를 나타내기 때문에 인플루엔자 치료 및 예방에 널리 사용되고 있다[3]. 하지만 2008년 1월 노르웨이에서 NA 억제제인 oseltamivir에 대해 내성을 나타내는 계절 인플루엔자 A(H1N1)형 바이러스가 확인된 이후, 2009년 1월에는 전 세계적으로 95% 내성률을 보였다[4]. 특히, 2009년 신종 인플루엔자 A(H1N1)pdm 바이러스에서도 내성주가 확인됨에 따라, Global Influenza Surveillance Network(GISN)을 중심으로 NA 억제제 내성주 감시사업이 강화되고 있다.   우리나라도 이러한 중요성을 인지하고 2002년부터 항바이러스제 내성 감시체계를 통해 국내 바이러스주 일부에 대한 내성 여부를 조사하고 있다[5].
  본 조사를 통하여 2008-2009 절기 동안 국내 계절 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 및 신종 인플루엔자 A(H1N1)pdm 바이러스의 oseltamivir에 대한 내성율은 각각 99.8%와 0.5%로 나타났으며, zanamivir에 대한 내성 분석 결과에서는 모두 감수성을 유지하고 있음을 확인하였다. 그리고 amantadine 내성율은 국내 계절 인플루엔자 A(H1N1) 바이러스 및 신종 인플루엔자 A(H1N1)pdm 바이러스 각각 2.2%와 100.0%로 나타났다. 국내 계절 인플루엔자 A(H3N2) 바이러스에서 amantadine의 내성율은 99.3%이었으나, oseltamivir 및 zanamivir에 대해서는 모두 감수성을 나타냈다. 계절 인플루엔자 B형 바이러스는 oseltamivir 및 zanamivir에 대해서 모두 감수성으로 확인되었다.
  이와 같은 국내 인플루엔자 바이러스 내성주 분석 자료는 인플루엔자 치료제인 항바이러스제의 효과적인 사용과 관련된 정보로서 현재 질병관리본부 홈페이지(http://www.kdca.go.kr)를 통하여 일선 의료인들에게 제공하고 있다. 또한 본 결과는 전 세계 인플루엔자 감시체계인 Global Influenza Surveillance Network(GISN)에 제공됨으로써 전 세계적인 인플루엔자 내성주 발생 양상 분석에 활용되고 있다.
  2009년 발생한 신종 인플루엔자로 인해 전 세계적으로 항바이러스제(특히 oseltamivir) 비축 및 사용이 증대되고 있으므로, 향후 검사 대상 확대 등 인플루엔자 바이러스를 대상으로 한 항바이러스제 내성주 감시체계를 보다 강화하여 효과적인 인플루엔자 치료지침 확립에 활용하고자 한다.

Ⅳ. 참고문헌

 1. World Health organization(WHO), 2008. Influenza A(H1N1) virus resistance to oseltamivir. 2008.08.20.
 2. World Health organization(WHO), 2009. Pandemic(H1N1) 2009: antiviral drug resistance. 2009.12.22.  
 3. McKimm-Breschkin, J.L., 2000. Resistance of influenza viruses to neuraminidase inhibitors-a review. Antiviral Res. 47, 1-17.
 4. World Health organization(WHO), 2009. Influenza A(H1N1) virus resistance to oseltamivir-2008/2009 influenza season, nothern hemisphere. 2009.03.18.
 5. Choi W.Y., Kim S.J., Lee N.J., et al., 2009. Amantadine-resistant influenza A viruses isolated in South Korea from 2003 to 2009. Antiviral Res. 84, 199-202.

 
 

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