국내 구토형 바실러스 세레우스 감시 및 독소 유형
Surveillance and toxin profile of emetic toxin producing Bacillus cereus in Korea

     
질병관리본부 국립보건연구원 감염병센터 장내세균과     
    

Ⅰ. 들어가는 말
  Bacillus 속의 박테리아는 대부분의 환경 속에 존재하고 있으며, 현재 약 148개의 종으로 분류되고 있다. 이 중에서 Bacillus cereus group에 속하는 종은 7가지로 B. cereus sensu stricto, B. thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, B. weihenstenstephanensis가 포함된다[1]. Bacillus spp.는 포자를 형성(65-75℃)하기 때문에 음식을 조리하는 과정 중에 열처리에 의해 사멸되지 않으므로 우유, 인스턴트 식품 그리고 가정에서 조리하는 음식에서도 생존한다. 또한 생존 온도에 제한이 적어 낮은 온도에서도 생존할 뿐만 아니라 생장하는 특성을 지니고 있어 냉장 보관된 식품 및 식재료에서도 증식한다. B. cereus sensu stricto는 인체에 감염된 후 크게 두가지 증상을 유발하게 되는데, 설사 증상을 야기하는 설사형과 구토를 유발하게 하는 구토형이 있다[2]. 설사 증상을 유발하는 대표적인 독소로는 Hemolysin BL(HBL), Nonhemolytic enterotoxin(NHE)이 있으며, 이들 독소는 단백질 복합체로 구성되고 감염 후 8-16시간의 잠복기를 거쳐 복통과 설사를 동반하는 증상이 나타난다. 구토형의 경우에는 cereulide라는 독소에 의해 메스꺼움과 구토 등의 증상을 유발하며 일부의 경우에는 설사 증상을 동반하기도 하며 잠복기는 1-5시간 정도로 보고되고 있다. B. cereus sensu stricto에 의한 식품매개 질환성 집단 발병은 나라마다 차이를 나타내는 것으로 알려져 있으나, 이는 각 나라마다의 보고 시스템에 의한 차이라고 알려져 있다[3]. 네델란드의 경우 1991-1994년까지의 집단 발병 사례 중 가장 많은 원인  병원체(19%)로 보고되고 있으며, 일본의 경우에는 0.7%만이 집단 발병 원인 병원체로 보고되고 있다. 또한 아시아 지역에서는 구토형 독소에 의한 집단 발병이 많이 발생하는 반면 유럽과 북아메리카 지역에서는 설사형 감염이 많이 발생하는 것으로 알려져 있다[3]. 설사형의 경우 진단은 비교적 간단하여 선택배지를 통한 병원체의 분리와 설사형 독소의 유전학적 진단이 가능하며, 독소 발현을 최종 확인하는 immunoassay 키트(BCET-RPLA(Oxoid, Hampshire, UK)와 Tecra ELISA(Tecra International Pty Ltd., NSW, Australia) 등이 사용되고 있다. 그러나 구토형 감염을 유발하는 cereulide는 유전자로부터 유래하는 독소가 아닌 아미노산들을 새로이 조합하여 구성된 약 1.2kDa의 peptide로 알려져 있으며,  열에 매우 안정적이며 항원성이 없는 것으로 알려져 있다. 이러한 원인들로 인해 유전학적 진단 및   면역학적 진단이 힘들었으나, 최근들어 cereulide를 생성하는 펩타이드 합성 효소(non-ribosomal peptide synthetase, NRPS)의 특징이 밝혀지면서 유전학적 진단법이 보고되고 있다[4]. 유전학적 진단 외에 독소의 세포 독성을 측정하는 방법들이 개발되어 보고되고 있는 실정이다.
  국내의 경우, 2007년까지 수인성·식품매개성 감염병 감시와 17개 시·도 보건환경연구원을 통한 집단 식중독 원인균 분리를 통해 지속적으로 B. cereus 및 설사 원인균 분리를 모니터링하였으며, 2008년 이후로는 집단 식중독 발생건에 한하여 B. cereus 감염을 확인하고 있다. 구토형 B. cereus 의 경우 2008년부터 진단법이 확립되었으며, 이를 바탕으로 집단 식중독 발생 원인균으로 밝혀진 병원체를 대상으로 진단하고 있다.

Ⅱ. 몸 말

  2005년부터 2007년까지 급성설사질환의 원인 규명을 위하여 전국 17개 시·도 보건환경연구원과   연계하여 설사 환자 대변 검체에서 병원성 세균을 분리하였다. 수집된 검체를 선택배지(MYP media, Oxoid, Hampshre, UK)에 접종 후 깃털모양의 분홍색 집락을 선별하여 API 20E kit와 API 50 CHB kit(bioMerieux, Marcy-L、Etoile, France)를 이용하여 생화학적 검사를 시행하였다. B. cereus로   동정된 균주를 대상으로 게놈 유전자를 추출하여 10개의 독소유전자를 검출하는 primer와 i-Star Master mix PCR kit(iNtRON biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하여 PCR을 시행하였으며, HBL 독소와 NHE 독소의 발현 여부를 확인하기 위하여 BCET RPLA(Oxoid, Hampshire, UK)와 Tecra ELISA(Tecra International Pty Ltd) kit를 이용하여 독소 단백질 검사를 확인하였다.
  2005년부터 2007년까지의 급성설사질환자 실험실 감시사업 결과, B. cereus의 월별분리분포는 병원성 장내세균(pathogenic E. coli, Salmonella spp, Staphlylococcus aureus)의 전형적인 월별 분리 분포와 유사한 결과를 보였다(Figure 1). 또한 병원체의 급격한 증가를 보이지는 않았으나, 매년 병원체의   분리수가 증가하는 추세이다. 그러나 2007년까지 구토형 B. cereus 에 대한 보고가 없었다. 2008년   이후 구토형 독소에 진단법을 확립하고 곡류에서 분리된 B. cereus 와 설사 및 구토 증상이 있는 환자로부터 분리된 B. cereus 에서 cereulide를 합성하는 NRPS 효소 유전자를 진단하고 독소의 생산을 확인한 결과 식품(선식류) 및 환자 분리주에서 구토독소의 생성을 확인할 수 있었다(Figure 2). 설사원인의 독소로 알려진 HBL 독소를 encoding하는 유전자는  환자분리주의 경우 hbl 유전자가 존재하지 않는 특성을 보였다. 또한 사람 분리주 중 2주는 NRPS 유전자를 보유하지 않았으나 cereulide의 생성을   세포 독성 실험을 통하여 확인할 수 있었다. 이는 cereulide가 NRPS 효소에 의존적이지 않게 생성되는 것으로 판단된다.
                                                
  병원체의 특성상 집단발생의 경우 유전학적 근연관계를 분석하기 위해 PFGE로 분석하기에는 어려움이 있다. 또한 PFGE 분석시간이 최소 6일이 소요됨으로 보다 신속한 유전학적 근연관계를 분석하고자 rep-PCR 방법을 도입하여 수행하였다. 식품 분리주와 PFGE 분석이 불가능한 7주를 대상으로 수행하였으며, 분석시간은 2일이 소요되었다(Figure 2).
  · 국내 최초 구토형 B. cereus 집단 감염 사례
  2008년 3월 11명이 생선회를 섭식하였으며, 이들 중 6명이 동일 22:00부터 설사, 복통, 메스꺼움, 구토 증상을 보여 환자 검체를 채취하여 원인 병원체 검사를 실시하였다. 6명의 환자 이외에 5명의 무증상자의 검체를 채취하여 동일한 검사를 실시하였다. 역학조사 결과, 3명의 환자는 설사와 구토를 동반하는 증상을 보였으며, 나머지 3명의 환자는 복통만을 호소하였다. 11건의 검체 중 6명의 환자와 2명의 무증상자에서 B. cereus가 분리되었으며, 독소 유전자 검사와 구토형 독소 세포 독성실험, 그리고 PFGE를 수행하였다. Hep-2 세포를 이용한 독소 생산 실험을 한 결과 모두 1:128이상의 높은 독소 생성능을 보였다(Figure 4). 유전자분석에서는 8주 모두가 hbl 유전자를 보유하지 않았으며 NRPS 유전자는 모두 보유하고 있는  동일한 양상을 나타내었다. 또한 집단 발생의 유전학적 근연관계를 확인한 결과 100%의 상동성을 보여 모두 동일한 오염원에 의해 감염된 것임을 확인하였다(Figure 3)[5].

Ⅲ. 맺는 말

  Bacillus spp.는 자연계에 광범위하게 존재하며, 열악한 환경에서도 생존하는 능력을 가지고 있다.  B. cereus 의 경우 다양한 독소들을 생성하고 있으며, 이들 독소 종류에 의해 설사 및 구토를 야기한다. B. cereus 에 의한 감염은 증상이 심하지 않으며, 수일 내에 자연 치유되는 경우가 많아 병원에 내원하는 경우가 드물어 실제 감염률에 비해 보고되지 않는 경우가 많다. 또한 B. cereus 의 감염 증상별로 설사를 유발하는 경우에는 Clostridium perfringens 와 잠복기 및 증상이 유사하며, 구토를 유발하는 경우에는 Staphylococcus aureus 독소 감염 증상과 유사하여 정확한 진단 및 원인 병원체 분리에 어려움이 있다. 국내에서 발생하는 B. cereus 의 감염증에 대한 통계는 질병관리본부 국립보건연구원 급성 설사질환자 실험실 감시망 사업 2007년도 자료[6]에 의하면 전국적으로 5,345주의 설사 유발 세균이 분리 되었으며 B. cereus 는 분리된 설사 유발 원인균 중 6.3%인 337주가 분리되었다.
  1970년대 초반 영국의 중국식당에서 조리된 쌀에 의해 감염된 것을 시작으로 1989년까지 11개 국가에서 200여건의 구토형 집단발생이 보고되었다. 구토형 B. cereus 의 오염원으로 알려진 원인식품으로는 전분 성분의 파스타, 유아 이유식 등에서 주로 분리되며, 특히 생쌀과 조리된 쌀에서 10-100% 구토형 B. cereus 가 오염되어 있는 것으로 보고되었다[7]. 2007년 이전에는 구토형 B. cereus 진단이 수행되지 않아 국내 구토형 B. cereus 의 발생 빈도를 추측하기는 어려운 실정이나, 구토형 B. cereus 오염이 원인 식품으로 알려진 쌀 등을 주식으로 하는 국내 실정에서 잠재적인 환자의 발생 가능성이 높을것으로   예상된다. 이에 2007년 이전에 분리된 병원체를 대상으로 구토형 B. cereus 진단을 통해 정확한 국내 발생 현황 자료의 축적과 보다 신속하고 표준화된 진단법이 마련되어야 할 것이다.

Ⅳ. 참고문헌

 1. Bavykin, S.G., Lysov, Y.P., Zakhariev, V., Kelly, J.J., Jackman, J., Stahl, D.A. and Cherni, A. 2004. Use of 16s rRNA, 23s rRNA and gryB genes
     sequence analysis to determine phylogenetic relationships of Bacillus cereus group microoranisms. J. Clin. Microbiol. 24, 3711-3730.
 2. Granum P.E: Bacillus cereus. In Food Miceobiology: Fundamental and Frontiers 2nd edition. Edited by: Doyle MP. Washington D.C., ASM Press; 2001:373-
     381.
 3. Kramer, J.M., Gilbert, R.J., in: Doyle M.P(Ed), Foodborne Bacterial Pathogens, Marcel Dekker Inc., New York, 1989, pp. 21-70.
 4. Ehling-Schulz, M., Vokov, N., Schulz, A., Shaheen, R., Anderson, M., Martlbauer, E., and Scherer, S. 2005. Identification and partial characterization of
     the nonribosomal peptide synthetase gene responsible for cereulide production in emetic Bacillus cereus. Appl. Environ. Microbiol. 71(1); 105-113.
 5. Kim J.H., Lim E.G., Jang H.C., Park. J.Y., Lee. S.J., Park. M.S., Choi G.B. and Lee B.K. A case of emetic toxin producing Bacillus cereus strains isolated
     from outbreak. 2009. Krean J. Clin. Micrbiol. 12(1):48-52.
 6. Division of Enteric Bacterial Infections, Division of Enteric and Hepatitis viruses, Division of Malaria and Parasitic Diseases. Surveillance Network of
     Water-borne and Food-borne disease. 1th ed. Seoul; Center for Infectious Diseases, National Institute of Health, 2007:7-31.
 7. Taylor J.M, Sutherland A.D, Aidoo K.E, Logan N.A. Heat-stable toxin production by strains of Bacillus cereus, Bacillus firmus, Bacillus megaterium,
     Bacillus simplex and Bacillus licheniformis. FEMS Microbiol Lett 2005;242:313-7.