인간 배아줄기세포은행 운영에서 미생물 안전성에 대한 고찰
Consideration of microbiological safety in human embryonic stem cell banking

질병관리본부 국립보건연구원 생명의과학센터 난치성질환과
  

Ⅰ. 들어가는 말
  인간 배아줄기세포는 무한히 자가 증식되고 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고   있다. 이러한 특성 때문에 인간 배아줄기세포는 난치성 질환의 새로운 치료제 및 재생의학 분야에서 그 가치가 증대되고 있어 생명윤리적 논란에도 불구하고 기술 선점을 위한 국제적 경쟁이 치열한 상황이다. 또한 최근 미국 제론사의 인간 배아줄기세포 임상시험 승인으로 1998년 첫 인간 배아줄기세포의 수립 이래 실제적 임상적용이 가시화되고 있다. 품질이 검증된 인간 배아줄기세포를 이용하는 것은 연구자들의 안전성 확보와 재연성이 높은 연구 수행과 함께 효과적 임상적용에 있어 매우 중요한 요소로 작용한다. 특히 세포 배양 및 보존 과정 중 박테리아와 바이러스 등의 생물학적 유해 인자에 의한 오염은 연구  결과의 재연성을 크게 저하시킬 뿐만 아니라 임상 적용 시 환자에게 치명적 위험을 초래할 수 있다.  따라서 줄기세포은행 또는 줄기세포연구실에서는 미생물 등의 생물학적 오염원에 대하여 지속적으로  모니터링하고 제어할 수 있는 시스템을 구축하는 것이 반드시 필요하다. 이 글에서는 줄기세포 은행에서 요구되는 미생물 및 마이코플라스마 등의 생물학적 안전성에 대한 국제적인 권고사항을 검토하고자   한다.

Ⅱ. 몸 말

  인간 배아줄기세포는 현재 전 세계적으로 700여 종 이상, 국내에도 70여 종의 세포주가 수립된 것으로 알려져 있다. 그러나 인간 배아줄기세포주는 배양 환경에 따라 다양한 특성 차이를 보이는 것으로 알려져 표준화가 절실히 요구되고 있다. 전문가들은 세포주와 조직 및 그 부산물 등 양질의 생물학적 자원을 확보하기 위하여 국제적 협의를 통하여 우수세포배양기준(Good cell culture practice)과 가이드라인을 확립하여 왔다[1, 2]. 시험관 내에서 배양된 인간 배아줄기세포와 그 부산물이 적절히 계대 배양, 분화 및 유전자적 조작이 가능하도록 최적화하는 것은 앞으로 해결해야 할 과제로 남아 있다. 인간 배아줄기세포 배양 과정에서 동물 매개성 감염과 마이코플라스마와 미생물 감염 등의 잠재적인 위험 요소를   배제하여 세포주의 순도(purity)를 높이는 것은 임상적용 시 안전성 확보뿐만 아니라 연구자들을 보호하기 위해서도 중요하다. 국제줄기세포포럼(Internatio-nal stem cell forum; ISCF) 산하의 국제인간배아줄기세포은행 이니셔티브(International stem cell bank initiative; ISCBI)는 2009년 연구용 인간배아줄기세포은행의 운영에 관한 가이드라인을 발표하였다[3]. 다음에서 ISCBI 가이드라인 중심으로 줄기세포은행 및 연구기관에서 제시하는 미생물 안전성에 대한 품질 평가 및 관리에 대하여 소개하고자 한다[3, 4, 5].    줄기세포은행 운영 시 미생물 오염의 제어는 매우 중요한 사항으로 원칙적으로 살균과 마이코플라스마
오염 검사는 모든 세포 배양 단계에서 철저하게 이루어져야 한다. 줄기세포은행에서는 고려할 대상은 크게 1) 공여자 검사, 2) 지지세포(feeder cell), 줄기세포주와 그 산물 또는 생물학 시료, 3) 환경적  인자로 배양 환경, 작업 환경, 실험실 및 세포 저장 환경, 4) 안전성 테스트 제도의 분야로 나눌 수   있다. 줄기세포은행은 각종 미생물 오염을 조사, 위험성 평가와 오염원 처리에 대한 적절한 기준을 마련해야 한다. 이 과정에서 조사 방법과 오염 정도는 감수성(sensitivity), 특이성(specificity), 강건성(robustness), 및 유효성 검증(validation)의 정보를 가지고 있어야 한다.
  세포 배양과 관련된 생물학적 시료 등의 원천 물질에 대한 위해 평가 기준을 마련하여 유해성 인자의 확산을 막아야 한다. Table 1은 줄기세포 수립, 배양 과정에서 잠정적 미생물 위해 인자를 포함하고 있는 생물학적 시료들을 열거하였다.

  박테리아 등의 미생물 오염은 배양실 표면과 공기로부터 기인할 수 있으며, 배양 과정 중 현미경   관찰과 더불어 배양액의 혼탁도와 pH 변화 등 육안으로도 확인이 가능하다. 사람의 피부로부터 전달되는 박테리아 Staphy-lococcus spp., Micrococcus spp., Corynebactrium spp., 공기 중의 박테리아 포자 Bacillus spp., 곰팡이 포자 Aspergillus niger, Penicillium spp.와 그람 음성균 중 Enterobacter cloacae, Burkholderia cepacia가 대표적으로 청정실에서 발견되는 미생물 종류들로 알려져 있다[5]. 세포 배양 중 박테리아 등의 오염이 감지된 경우 즉시 배양을 중단하고 오염된 세포나 재료를 멸균   처리 후 폐기함으로써 추가적인 미생물 오염 확산을 막아야 한다.  
  줄기세포은행에서는 다양한 종류의 바이러스에 대한 오염 여부를 모두 확인하기는 어려우나, 바이러스 모니터링을 포함한 지속적인 위해성 평가 프로그램을 유지할 필요성은 있다. 위해성 평가와 검사 항목들은 기존의 혈액은행과 조직은행 등에서 사용하는 방법을 사용할 수 있다. 줄기세포은행에서 검사해야 할 바이러스 종은 심각한 혈액 유래 병원체 중 최소한의 항목을 지정하고 있다. 우선적으로 조사가 요구되는 바이러스 항목은 Table 2에 보는 바와 같다. 이들 바이러스 오염 여부는 배아와 수정란 등 공여자 검사에서 원천적으로 요구되며 줄기세포주 수립 이후에도 오염될 가능성이 있음을 유의해야 한다.
  마이코플라스마는 일반적으로 동물유래혈청(예, bovine), 지지세포(feeder cell), 동물유래물(예, trypsin), 혹은 사람으로부터 감염을 통해 오염될 수 있고, 실제로 많은 실험실에서 배양 중이거나 저장되어 있는 세포에 오염되어 있다. 마이코플라스마에 감염된 세포는 세포대사 및 형태와 염색체 구조에 이상을 초래할 수 있다. 보고된 바에 의하면 마이코플라스마는 포유동물세포를 이용하는 연구실 중에서 15-30% 이상이 감염된 것으로 알려져 있다. 약 20여 종의 마이코플라스마 오염이 보고되어 있으며,  그 중 Mycoplasma hyorhinis(porcine trypsin), M. arginini(bovine serum), M. fermentans(human), Acholeplasma laidlawii, M. hominus(human), M. orale(human), M. bovis(bovine), M. pulmonis(murine)의 8종이 가장 빈번히 검출되는 종류로 알려져 있다. 마이코플라스마는 그 크기가 0.15-2 μm으로 매우 작기 때문에 필터를 이용한 멸균이 불가능하다. 또한 세포 배양 중 혼탁도 검사와 같은 육안 확인 방법으로는 마이코플라스마의 오염을 확인할 수도 없다. 마이코플라스마를 확인하는  방법은 Table 3과 같다. 마이코플라스마는 오염 빈도가 높아 우수한 세포은행 환경을 유지하기 위해서는 초기 반입되는 물품과 세포주에 대한 오염 진단과 주기적인 검사를 통하여 오염 확산을 막아야 한다.

Ⅲ. 맺는 말

  인간 배아줄기세포는 현대의학으로 치유가 불가능한 손상과 각종 난치성 질환의 새로운 치료수단으로 주목받고 있다. 그러나 인간 배아줄기세포의 임상 적용을 위해서는 양질의 세포주 확보와 더불어 품질 표준화 등 향후 해결되어야 할 중요한 문제들이 있다. 미생물에 오염된 세포는 세포변성 등의 문제로 연구결과의 재연성을 저하시키고, 환자와 연구자들에게 감염될 수 있는 위험 요소로 작용할 수 있다.  따라서 줄기세포은행과 줄기세포 연구실에서는 우수한 연구 결과의 도출과 줄기세포의 안전성 확보를 위하여 마이코플라스마 등 미생물에 대한 지속적인 모니터링 및 제어 시스템을 마련하여야 할 것이다.

Ⅳ. 참고문헌

1. Coecke, S., Balls, M., Bowe, G., Davis, J., Gstraunthaler, G., Hartung, T et al.. 2005. Second ECVAM task force on good cell culture practice. Guidance on good cell culture practice: a report of second ECVAM task force in good cell culture practice. Alternative to Lab. Animals 33: 261-287.
2. OECD. 2007. Best practices guidelines for biological resource centres; OECD, Paris. http://www.oecd.org/document/50/0,3343,en_2649_201185_1911986_1_1_1_1,00.html
3. The International Stem Cell Banking Initiative. 2009. Consensus guidance for banking and supply of human embryonic stem cell lines for research purpose. Stem Cell Rev. and Rep. 5:301-314.
4. Cobo, F., Stacey, G. N., Hunt C., Nieto, A., Montes, R., Cortes, J. L. Catalina., P., Barnie., A., and Concha, A. 2005. Microbiological control in stem cell banks : approaches to standardization. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68:456-466. 
5. Cobo., F., and Concha. 2007. Environmental microbial contamination in stem cell bank. Letters in Appl. Microbiol. 44: 379-386.