Abstract

Background: Influenza viruses have circulated in human population with antigenic modification. Particularly, some Type A influenza viruses cause pathogenesis in birds and mammals including human beings. Moreover, highly pathogenic avian influenza viruses such as H5N1 originated avian influenza H7N9; thus, this is a persistent public health threat. When AI or PI outbreak occurs, it is crucial to prepare against influenza pandemic by evaluating pathogenesis of newly-emerged influenza viruses. Genetic and biological characterizations are commonly conducted for risk assessment. However, animal experiments should be strongly supported to predict pathogenesis in humans. Mammals, including ferrets and mice, are commonly used to characterize the pathology of influenza viruses. In particular, ferrets are known to be susceptible to influenza virus infection and show fever and clinical respiratory signs similar to humans such as nasal discharge, sneezing, and coughing. In a mice experiment, the objective values (Mouse lethal dose 50, MLD50) of influenza viruses exhibited some characteristics such as highly pathogenic or low pathogenic.
Current status: Using ferrets, we demonstrated the pathogenesis of H5N8 highly pathogenic avian influenza isolates in Korea in 2015. The H5N8 isolates showed low pathogenesis in intra-nasally challenged ferrets. Transmission study using ferrets was conducted to figure out transmissibility of Korea H5N8 isolate.
Prospective future: As time passed by, animal ethics has become stricter, such that permits are only issued to a restricted number of animals; humanity is also emphasized during experiments. Accordingly, ferrets and mice models are necessary to evaluate pathogenesis of influenza. Therefore, appropriate design of mammalian model is critical after characterization of novel influenza virus. Furthermore, continuous efforts should be exerted to minimize the number of animal experiments by supporting predictable information based on bioinformatics.



Ⅰ. 들어가는 말

Orthomyxoviridae과에 속하는 인플루엔자 바이러스는 8개의 분절된 RNA 가닥으로 이루어져 있으며 인체에서는 주로 A형이 높은 병원성을 나타내는 것으로 알려져 있다(1). 인플루엔자 바이러스는 분절 내 antigenic drift와 분절 간 antigenic shift를 통해서 지속적으로 진화하고 하기 때문에 세계보건기구는 인플루엔자 감시체계를 통하여 매년 계절인플루엔자 백신주를 업데이트하고 있다. 하지만 1997년 홍콩에서 처음 인체감염이 보고된 이후, 고병원성 조류인플루엔자 H5N1형(2)이 꾸준히 발생하고 있으며 현재까지 844명의 감염환자 중 60%의 높은 치사율을 보이고 있다(WHO, 2015년 11월13일 기준). 또한 인근 국가인 중국에서 2013년 이후 조류인플루엔자 H7N9형에 의한 인체감염이 지속적으로 발생하여(3) 현재까지 677명의 확진 환자 중 275명이 사망하였다(WHO, 2015년 7월17일 기준). 또한, 국내에서는 2014년 이후 닭, 오리 농장에서 지속적으로 고병원성 조류인플루엔자 H5N8형이 발생하고 있어 조류인플루엔자 바이러스의 상재화가 우려되는 상황이다. 이처럼 다양한 조류인플루엔자 (H5N1, H7N9, H6N1, H9N2, H10N8 등)에 의한 인체감염증이 보고되면서 신종 (Novel) 조류인플루엔자 바이러스에 대한 신속한 위해도 평가가 매우 중요해졌다. 인플루엔자 위해도 평가방법(Influenza Risk assessment tool, IRAT)은 인체감염 특성변화, 실험동물에서의 전파능력, 수용체 친화도, 집단면역, 실험동물 감염력, 유전자, 항원형 분석 등 다양한 정보를 분석하여 대유행으로 확산될 가능성을 객관적으로 수치화함으로써 인플루엔자의 위해도를 평가할 수 있다. 따라서 진화하고 있는 조류 인플루엔자 바이러스가 대유행으로 진행될 수 있는 가능성을 파악하기 위해서 IRAT를 통한 지속적인 모니터링이 필수적이다. 조류 인플루엔자 바이러스의 인체감염 위해도와 관련된 병원성, 전파, 백신연구 등에 가장 많이 사용되는 실험동물 모델로는 마우스와 족제비 (페렛)가 있으며(4) 이외에도 커튼렛, 기니픽, 햄스터, 원숭이도 인플루엔자 연구에 사용되기도 한다. 본 연구에서는 페렛 모델을 이용하여 2014년도 국내 조류에서 발생한 고병원성 조류인플루엔자 H5N8 (부안주: A/broiler duck/Korea/Buan2/2014,
고창주: A/breeder duck/Korea/Gochang1/2014)의 병원성을 평가한 방법 및 결과를 제시함으로써 인플루엔자 실험동물을 이용한 병원성 분석 등 관련 연구를 설명하고자 한다.


Ⅱ. 몸 말

1. 인플루엔자 실험에 사용되는 포유동물 모델

1) 마우스: 마우스는 인플루엔자 실험동물 모델로 가장 보편적으로 사용 되지만 모든 인플루엔자 바이러스에 대해서 감수성이 있는 것은 아니다. 주로 inbred인 Balb/C를 많이 사용하며 비강을 통하여 인플루엔자 바이러스를 접종하여 체중 변화 및 폐사율을 파악하여 병원성을 평가한다. 마우스 반수 치사농도 (Mouse lethal dose 50, MLD50)을 평가함으로써 인플루엔자 바이러스에 대한 병원성을 객관적인 수치로 비교할 수 있다(103.8MLD50 미만은 병원성이 높은 것으로 간주)(5). 마우스 간 개체차가 적기 때문에 병원성 및 백신연구에서 신뢰도가 높은 결과 값을 구할 수 있으나 바이러스 종류에 따라 감수성이 없는 경우 추가적인 적응 (adaptation) 단계가 필요하며, 인플루엔자 바이러스 접종 후, 털 거침 이외의 뚜렷한 임상증상을 확인할 수 없는 단점을 지니고 있다. 인플루엔자 연구에서 마우스는 임신 실험동물 모델로도 사용가능하며 Knockout 모델을 만들어서 특이 유전자의 기능을 연구하기도 한다.

2) 페렛 (ferret): 페렛은 족제비과의 동물로 대부분의 인플루엔자바이러스에 감수성을 나타내며 사람과 같이 계절인플루엔자 바이러스에 자연감염 되기 때문에 반드시 인플루엔자 바이러스 연구에 페렛을 사용하기 전에 계절인플루엔자 바이러스에 대한 항체가 검사를 수행해야 한다. 페렛의 경우 주로 비강(intra-nasal)인 상부호흡기를 통해서 감염 시키나 더욱 공격적인 방법으로 기관 (intra-tracheal)을 통하여 인플루엔자 바이러스를 하부호흡기도로 접종하기도 한다. 인플루엔자 바이러스는 고열을 동반하는 호흡기 질병이므로 페렛에 인플루엔자 바이러스 접종 후 체온, 체중, 폐사율 및 임상증상(재채기, 콧물, 기침을 동반하는 호흡기 증상) 측정이 가능하기 때문에 인플루엔자 병원성 연구에 반드시 필수적인 실험동물 모델이다(6). 페렛은 위와 같은 뚜렷한 임상증상을 보이기 때문에 전파모델로(직접접촉전파, 비말전파 및 공기전파) 도 많이 사용된다. 하지만 대부분의 페렛은 outbred 이므로 개체 차이를 고려해야하며 제한적 공간의 전용 사육케이지가 필요할 뿐만 아니라 고가의 실험동물이기 때문에 동물실험을 수행하는데 제한이 있다.

2. 페렛을 이용한 국내 분리주 고병원성 조류인플루엔자 H5N8의 병원성 평가

- 부안주(A/broiler duck/Korea/Buan2/2014)를 페렛의 비강으로 공격접종 한 결과 감염 5일째 가장 높은 고열을 보였으며 (1.6℃) 감염 7일 이후 정상 체온으로 회복되었다. 감염 10일째까지 8.3%의 체중저하를 보였으며 8마리의 페렛 중 4마리에서 감염 3일째 경미한 콧물과 재채기 증상을 보였으나 이후 모두 회복되었으며 실험기간동안 폐사는 관찰되지 않았다. 고창주(A/breeder duck/Korea/Gochang1/2014)를 페렛의 비강으로 공격접종 한 결과 감염 5일째 0.7℃의 미열을 보이다가 정상 체온으로 회복되었으며 감염 10일째 7.5%의 체중감소를 보였다. 고창주에 감염된 페렛은 모두 임상증상을 보이지 않았다(Table 1). 부안주를 감염시킨 페렛에서는 5일째까지 코중격 (Nasal turbinate)에서 2.0 (LogEID50/ml)의 H5N8 바이러스가 검출되었으나 폐에서는 바이러스가 검출되지 않았다. 고창주를 감염시킨 페렛에서는 3일째 코중격에서만 바이러스가 검출되었다(Table 2). 감염된 폐의 조직병리학적 검사 결과 부안주를 감염시킨 페렛에서는 감염 5일째까지 중등도의 염증 소견에 의한 간질성 폐렴증상이 나타났으며, 고창주의 경우는 감염 3일째까지 미약한 염증소견이 보였다(Figure 1). 면역조직화학적검사 결과 부안주 및 고창주를 감염시킨 페렛의 폐에서 바이러스가 검출되지 않았다(Figure 2)(7).


Ⅲ. 맺음 말

본 연구에서는 인플루엔자 바이러스 실험동물 모델로 가장 많이 사용되는 페렛을 이용하여 2014년 국내에서 발생한 H5N8 고병원성 조류인플루엔자에 대한 인체 위해도 평가를 수행하였다. 바이러스 접종 후 페렛의 상부호흡기도에서만 바이러스가 검출되었으며 뚜렷한 임상증상을 보이지 않은 것으로 보아 H5N8 고병원성 조류인플루엔자는 포유류에 적응이 덜된 바이러스이므로 인체위해도가 낮은 것으로 판단되었다. 그러나, 실제 인체감염시에는 개개인의 건강, 면역상태에 따라 다른 결과가 나타날 수 있으므로 동물실험결과만으로는 인체감염가능성을 완전히 배제할 수는 없다. 그럼에도 불구하고 H5N8 고병원성 조류인플루엔자가 국내 가금 농장에서 지속적으로 발생하고 있으며 인근 아시아 국가에서도 H5N1 및 H7N9형 조류인플루엔자가 발생하고 있으므로 동물 실험을 통한 위해도 평가는 반드시 수행될 필요가 있다. 그중 페렛은 인플루엔자의 인체 위해도를 평가하는 가장 적합한 동물 모델이나 빈번한 실험이 어렵기 때문에 반드시 의미 있는 인플루엔자 바이러스를 선별하는 것이 필수적이다. 최근 생물정보학 분석기법의 발달과 인플루엔자 유전자 기능 연구가 활발하게 이루어져서 주요 유전자 분석만으로도 병원성 예측이 가능해졌으나 조류 인플루엔자 발생 시 유전자 분석과 특성분석을 통하여 바이러스에 대한 병원성을 일차적으로 분석한 후 제한적인 페렛 동물실험으로 인체 위해도 결과를 통해 종합적인 분석을 도출하는 것이 타당할 것으로 사료된다.




Ⅳ. 참고문헌

1. Baigent, Susan J., and John W. McCauley. "Influenza type A in humans, mammals and birds: determinants of virus virulence, host-range and interspecies transmission." Bioessays 25.7 (2003): 657-671.
2. Chan, Paul KS. "Outbreak of avian influenza A (H5N1) virus infection in Hong Kong in 1997." Clinical Infectious Diseases 34.Supplement 2 (2002): S58-S64.
3. Lam, Tommy Tsan-Yuk, et al. "The genesis and source of the H7N9 influenza viruses causing human infections in China." Nature 502.7470 (2013): 241-244.
4. Belser, Jessica A, et al. Pathogenesis of avian influenza (H7) virus infection in mice and ferrets: enhanced virulence of Eurasian H7N7 viruses isolated from humans. Journal of virology. 2007; 81.20: 11139-11147.
5. Maines, Taronna R., et al. "Avian influenza (H5N1) viruses isolated from humans in Asia in 2004 exhibit increased virulence in mammals." Journal of virology 79.18 (2005): 11788-11800.
6. Kim, Heui Man, et al. "Pathogenesis of novel reassortant avian influenza virus A (H5N8) Isolates in the ferret." Virology 481 (2015): 136-141.
7. Lee Youn-Jeong, et al. 2014. Novel reassortant influenza A (H5N8) viruses, South Korea, 2014. Emerging infectious diseases. 2014; 20.6: 1087.
8. Maines, Taronna R. et al. Avian influenza (H5N1) viruses isolated from humans in Asia in 2004 exhibit increased virulence in mammals. Journal of virology. 2005; 79.18: 11788-11800.