Abstract
BACKGROUND: Clonochis sinensis, a kind of liver fluke, is a parasite that causes the highest infection rates in Korea. Based from the results of the 8th nationwide survey of intestinal parasites, it is estimated that one million people have been infected with C. sinensis. Chronic infection of C. sinensis causes abnormal liver function and induces cholangiocarcinoma. Therefore, it is important to accurately and rapidly diagnose clonorchiasis caused by C. sinensis infection.
METHODOLOGY/RESULTS: Among several diagnostic tools for clonorchiasis, microscopic examination is used as the standard. Although microscopic examination is accurate, its disadvantage is that it requires a well-trained professional staff and above Biosafety Level 2 laboratory to properly diagnose the infection. Accordingly, several kinds of diagnostic tools and materials have been researched and developed. We tried to identify simple strategies in order to detect this parasitic infection. In this regard, we collected relevant references related to diagnosis of clonorchiasis and compared the respective advantages and disadvantages. Moreover, we conducted various experiments to develop more effective diagnostic means. Through high throughput approaches, we identified various antigenic proteins and peptides applicable to sero-diagnostic development for clonorchiasis.
CONCLUSION: This report provides the recent methodological advances and the identification of antigens. The integration of data from specific genes, antigens, and metabolites of C. sinensis might bring important information for the development of rapid and simple diagnosis of clonorchiasis.


들어가는 말

간흡충증은 아직도 우리나라에서 100만명의 감염자가 있을 것으로 추산되는 주요 기생충 감염병이다. 간흡충 감염의 진단은 현재 분변 충란 검출법이 표준검사법이며, 혈액에서 간흡충 특이 항체를 검출하는 ELISA 검사법이 상용화 되어 있다. 하지만 충란 검출 및 ELISA 검사법은 일정기준 요건을 갖춘 실험실과 장비를 필요로 하며, 고유행지역에서 감염여부를 신속하고 간단하게 진단할 수 있는 간편진단법의 구축은 아직 이루어지지 않고 있다. 이번 글에서는 간흡충 감염 퇴치를 위한 진단법 개선 필요성과 현재 다양하게 이루어지고 있는 연구개발 현황을 살펴보고 이를 바탕으로 한 관리전략을 고찰해 보고자 한다.


몸 말

사람에게 감염되어 간흡충증을 일으키는 종류에는 크게 3종류가 있는데 우리나라뿐만 아니라 중국남부와 베트남북부에서도 유행하는 중국간흡충(Clonorchis sinenesis), 베트남남부, 라오스, 캄보디아와 태국을 포함하는 동남아시아에서 유행하는 타이간흡충(Opisthorchis viverrini), 그리고 러시아 및 유럽일대에서 유행하는 고양이간흡충(Opisthorchis felineus)이 그 원인 병원체들이다. 이들 중 특히 중국간흡충과 타이간흡충은 유행지역에서 심각한 공중보건문제를 일으키는데 만성 감염에 의해 간담도에서 섬유화를 일으키고 담도암을 유도할 수 있는 높은 관련성으로 인해 국제보건기구(WHO) 산하 국제암연구위원회(IARC)에서는 간흡충을 1급 발암인자로 분류하였다[1].
유행지역에서 간흡충 만성 감염의 공중 보건학적인 위협을 해소하기 위해서는 다각적인 관리 노력이 수반되어야 한다. 질병관리본부에서는 1971년 시작된 전국 장내 기생충 감염실태 조사를 바탕으로 간흡충의 감염현황을 파악하고, 고유행지역 주민을 대상으로 매년 중점관리사업을 전개해 오고 있다. 회충을 포함한 토양매개기생충이 전국조사 및 치료제 배포사업을 통해 퇴치수준(감염률 1% 이하)을 유지하고 있는데 반하여, 간흡충 감염률은 1971년 4.6%에서 1976년에 1.8%로 감소하였으나, 그 이후 조사에는 2% 내외로 유지되고 있다[2](Figure 1).
간흡충 감염의 퇴치가 쉽지 않은 이유는 감염경로와 관리체계의 어려움을 이야기할 수 있겠다. 유충이 감염된 민물고기를 생식하여 일어나는 간흡충증은 식품매개성이란 기호습관 때문에 감염 위험을 쉽게 낮추기 어려운 실정이다. 일반적으로 약국에서 개인이 쉽게 구매하여 복용할 수 있는 기생충 치료제는 회충 등 선충류를 대상으로 하는 것이다. 이와 같은 선충류에 효과적인 치료제는 간흡충의 구충효과가 없으며, 간흡충 감염 치료를 위해서는 검체에서 충란을 검출하는 진단 과정을 거쳐 의사 처방으로 흡충류에 효과가 있는 치료제인 프라지콴텔(Praziquantel)을 복용해야 한다. 분변수거 후 현미경 검경을 통한 충란 검출까지의 복잡한 진단과정은 진단 후 치료제 처방이라는 관리 절차에서 가장 어려운 과정에 속한다.
질병관리본부 말라리아기생충과에서는 간흡충 감염률이 높은 지역을 선정하고 각 지역보건소와 연계하여 연간 4만 명의 주민을 대상으로 집중적인 검체 수거, 진단검사 및 치료제배포를 진행하고, 홍보 및 예방 교육 등을 실시해 왔다. 이를 통해 고유행 지역에서의 감염률을 10%에서 한 자리수대로 낮추는 성과를 나타내고 있으나, 1% 이하의 퇴치수준에 도달하기에는 현재의 관리체계로는 한계가 있다. 각 유행지역에서 검체 수집을 통한 중앙 집중식 실험실 진단 및 치료를 실시하는 실험실 진단체계로서는 퇴치수준으로 감염을 낮추기는 어렵다. 진단실험실을 각 유행지역에 설치 운영하여 진단 및 치료제 배포 기간을 크게 줄이면 감염률을 낮추는데 도움이 될 것이지만, 이를 위해 수반되어야 하는 시설 구축 및 전문 인력 운용을 위한 예산 투입 등이 효율적일 것인가에 대한 이견이 있는 실정이다.
이런 난관을 돌파하기 위한 방안 중의 하나로 진단법의 간편화를 제안할 수 있다. 감염률을 더 낮추기 위해서는 개인이 감염여부를 쉽게 확인할 수 있는 기술개발과 치료가 뒤이어 이루어 질 수 있는 관리 체계 개선을 고려해야 한다. 진단법 간편화는 검체 수거 및 진단대기 등에 소요되는 시간과 노력을 크게 감소시켜 유행지역에서 직접적이고 자체적인 관리를 가능케 하고, 감염예방교육 및 홍보효과를 상승시키는 요인이 될 것이다.
간흡충 감염 여부를 보다 간편하게 진단하기 위해 연구 개발되고 있는 다양한 진단법을 살펴보면 다음과 같다. 분변에서 충란을 직접현미경으로 관찰하는 것이 현재까지는 가장 정확한 진단법이지만 앞서 언급했듯이 이를 위해선 생물안전 2등급 이상의 실험실과 숙련된 진단인력이 필요하다. 또한, 현미경 검경을 통한 실험실 진단은 대량 집단 검사에 적합하지 않고, 투약 후 적은 수의 충란 배출 시에는 진단 민감도가 낮아지는 등의 단점이 있다. 이를 개선하기 위해 분변이나 혈액에서 간흡충에 특이적인 항체, 항원 또는 유전자를 진단하는 방법들이 연구 개발되어 왔다(Table 1). 피낭유충 감염 6-8주 후에 담관에서 성충으로 자란 간흡충은 충란을 분변으로 배출하고, 이 기간 동안 숙주의 면역체계는 간흡충 항원에 특이적인 항체를 생성하여 대응한다. 따라서 분변에는 충란 및 항원 등을 포함하는 간흡충 유래 물질이 포함되어 있을 것이며, 혈액에는 간흡충 특이항체가 존재할 것이다. 간편 진단법의 개발은 이러한 간흡충 유래 물질을 간단하고 신속하게 검출하는 것에 목표를 두고 있다.

검체에 따른 각 진단법의 간단한 원리와 연구 개발 현황을 소개하겠다. 먼저, 분변 검체에서 간흡충란의 유전자를 검출하는 유전자 증폭법(PCR)과 간흡충 유래 항원을 특이적으로 결합 분석하는 Copro-ELISA 검사법이 있다. 분변에서 충란을 현미경 검경하는 대신 유전자를 검출하는 PCR 진단법 연구는 간흡충 유전자에 대응하는 특이유전자 절편의 개발과 분변에 존재하는 유전자중합 억제요소의 제거에 집중되고 있으며, 민감도가 불안정한 PCR 검사법 한계 극복이 문제점이라 할 수 있다. 분변에서 간흡충 특이 항원에 항체를 결합시킨 후, 이 결합물을 분리하여 검출하므로서 감염여부를 확인할 수 있는 원리의 Copro-ELISA 진단법은 보다 간편한 검사법이지만, 항원과 보다 안정하게 결합할 수 있는 민감도 높은 항체의 개발과 항원-항체 결합물을 간편하고 효율적으로 분리할 수 있는 정제과정의 개선이 필요하다.
또 다른 접근으로 영상진단을 들 수 있다. 영상진단은 대부분의 임상진단기관에서 운용하고 있는 초음파기기를 활용하여 간내담관의 두꺼워짐 정도 등을 척도로 간흡충의 감염 여부를 진단하는 방법이다. 이 방법 역시 전문가의 역량에 크게 의존적이라는 단점이 있어 임상에서 쉽게 활용할 수 있는 간편 진단법에 대한 연구개발이 더 필요한 상황이다.
분변 이외에 혈액을 검체로 하여 혈청학적인 진단을 시도하는 연구들이 진행되어 왔다. 초창기에 피내반응검사(intradermal test 또는 skin test)가 보조적 임상 진단 수단으로 활용되었는데, 간흡충 성충의 파쇄물인 조항원을 피부에 주사하여 면역반응을 통해 피부가 부어오르는 정도를 측정하여 감염여부를 판단하는 진단법으로 정확도가 크게 떨어져 최근에는 거의 사용하지 않는다. 이후에 혈액에서 간흡충 특이항체를 검출하는 검사방법에 대한 연구들이 이루어져 왔으며, 현재 간흡충 조항원을 기반으로 하는 항체진단키트가 상용화 되어 있다. 이 검사방법의 단점은 지속적인 간흡충 조항원 확보 노력과 균일한 품질관리가 필요하다는 것이다. 또한 특이 항체를 검사하는 원리이기 때문에 과거에 감염되었던 사람이 이 검사를 통해 양성으로 확인될 수 있다는 단점도 있다. 그리고 확진이 가능한 정도로 민감도가 높지 않아 이를 향상시켜야 한다는 숙제가 있으며, 검사를 위해 고가의 분석 장비가 필요하다는 점도 간편진단이라는 측면에서 단점이라 할 수 있겠다. 하지만 혈액을 이용한다는 것은 쉽게 검체를 얻을 수 있다는 잇점이 있으므로 이러한 단점을 극복하기 위한 연구가 진행되고 있다. 간흡충의 파쇄물인 조항원을 대체하기 위한 민감도와 특이도가 높은 항원단백질을 발굴하는 노력과 간흡충 감염 치료 전후를 구분할 수 있는 항체 검사를 위해 감염환자 혈청에 존재하는 항체의 발현 변화를 추적하는 연구 등이 진행되고 있다. 질병관리본부 말라리아기생충과에서는 20여종에 달하는 항원단백질을 발굴하였으며, 이를 바탕으로 민감도와 특이도가 높은 항원 조합물을 개발하고 있다(Figure 2). 또한 감염 정도를 항체발현에 따라 다섯 종류로 분류하고 항체 변화 원인을 분석 중에 있다. 항원 개발과 항체 변화에 대한 분석이 종료되는 시점에서는 혈액을 이용한 간편진단키트 개발이 가능할 것으로 기대하고 있다.

이외에도 혈액에서 특이항체가 아닌 간흡충 유래 특이항원을 검출하여 과거 감염자를 양성으로 판정하는 단점을 극복할 수 있다는 연구 보고가 있으나, 혈액에 미량 존재하는 항원을 검출할 수 있는 민감도 높은 항체 개발이 어려운 점이다. 최근의 연구는 병원체 및 감염 숙주에서 유래하는 엑소좀(exosome)과 같은 분비성 과립에서 진단물질을 발굴하는 추세이다. 엑소좀에는 병원체 고유의 유전자(miRNA, DNA)와 단백질이 존재하고 있고, 체액에 분비되어 진단 활용에 용이한 장점이 있기 때문이다. 질병관리본부에서도 간흡충과 같은 기생충을 대상으로 엑소좀에 포함된 물질을 분석할 예정이며, 성공적인 연구결과가 나타나면 소변을 통해 임신여부를 간단히 확인하는 것처럼 혈액이나 소변에서 간흡충 감염여부를 개인이 쉽게 확인할 수 있을 것으로 기대한다.

맺는 말

간흡충증은 감염 후 증상이 바로 나타나지 않는 만성 감염질환이지만 담관암의 원인일 정도로 간 및 담도 건강에는 크게 위협적이다. 따라서 간흡충 만성 감염에 대해 민감도 높고 간편한 진단법을 개발한다면 그 위험을 해소하는데 크게 기여할 것이다. 우리나라는 간흡충퇴치 집중관리사업 초기에는 분변 1그램 당 충란수(Egg per gram, EPG)로 표기되는 간흡충감염강도가 대부분 중감염이었으나, 집중적인사업 결과 최근 감염강도는 100 EPG 이하로 낮은 경향성을 보이고 있다. 이 단계에서는 중앙집중식 진단 및 치료제 배포 사업과 병행하여 고유행지역에서의 현장 진단 체계를 구축하여 관리수준을 확대하여야 간흡충 퇴치라는 목표 수준에 도달할 수 있을 것이다. 이를 뒷받침하기 위해서는 경감염에 대해 높은 민감도를 나타내는 간편진단법의 연구와 개발이 지속적으로 이루어질 필요가 있다. 질병관리본부에서는 항원단백질을 활용한 간편혈청진단법 개발 외에도, 대사체 및 분비과립 등에서 진단물질 발굴 등의 다각적인 노력을 진행할 계획이다.


참고문헌

1. IARC. A Review of Human Carcinogens: Biological Agents. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum. 2012; 100(B):341-370.
2. Korea Centers for Disease Control and Prevention. Korea Nation Institute of Health. 2013. National survey of the prevalence of intestinal parasitic infections in Korea, 2012. The 8th Report. Osong Chungcheongbuk-do, Korea.
3. Hong, S. T., et al. (2003). The kato-katz method is reliable for diagnosis of Clonorchis sinensis infetion. Diagnostic and Infectious Disease, 47, 345-347
4. Cho, S. H., et al. (2008). Prevalence of Clonorchiasis in Southern Endemic Areas of Korea in 2006. Korean J Parasitol, 46(3), 133-137
5. Cai, X. Q., et al. (2014). Rapid Detection and Differentiation of Clonorchis sinensis and Opisthorchis viverrini Using Real-Time PCR and High Resolution Melting Analysis. The Scient World J, 893981
6. Rahman, S. M. M., et al. (2012). Coproantigen capture ELISA for detection of Clonorchis sinensis infection in experimentally infected rats. Parasitol Int, 61(1), 203–207
7. Han, S. et al. A Combination of the Kato-Katz Methods and ELISA to improve the diagnosis of Clonorchiasis in an Endemic Area, china. PLOS ONE, 7(10)
8. Nie, G., Wang, et al. (2014). Detection of Clonorchis sinensis circulating antigen in sera from Chinese patients by immunomagnetic bead ELISA based on IgY. PLoS ONE, 9(12)
9. Worasith, C., et al. (2015). Advances in the Diagnosis of Human Opisthorchiasis: Development of Opisthorchis viverrini Antigen Detection in Urine. PLoS NTD, 9(10)
10. Kim, Y. J., et al (2010). Performance of an Enzyme-Linked Immunosrobent Assay for Detection of Clonorchis sinensis Infestation in High -and Low-Risk Groups. J Clin Microbiol 48(7), 2635-2367
11. Choi, B. I., et al. (2004). Clonorchiasis and Cholangiocarcinoma: Etiologic Relationship and Imaging Diagnosis. Clin Microbiol Reviews, 17(3), 540–552