Abstract
Background: Bacillus anthracis is a pathogenic Gram-positive bacterium that causes a highly lethal infectious disease, anthrax. The poly-γ-D-glutamic acid (PGA) capsule is one of the major virulence factors of B. anthracis, along with exotoxins. PGA enables B. anthracis to escape phagocytosis and immune surveillance. Our previous study showed that PGA activated the human macrophage cell line THP-1 and human dendritic cells, resulting in the production of the proinflammatory cytokine interleukin-1 (IL-1).
Methods: We investigated PGA-induced cytokine responses and related signaling pathways in mouse bone marrow-derived macrophages (BMDMs) using Bacillus licheniformis PGA as a surrogate for B. anthracis PGA.
Results: Upon exposure to PGA, BMDMs produced proinflammatory mediators, including tumor necrosis factor alpha (TNF-α), IL-6, IL-12p40, and monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1), in a concentration-dependent manner. PGA stimulated toll-like receptor 2 (TLR2) but not TLR4 in Chinese hamster ovary cells expressing either TLR2 or TLR4. The ability of PGA to induce TNF-α and IL-6 was retained in TLR4-/- but not in TLR2-/- BMDMs. Blocking experiments with specific neutralizing antibodies for TLR1, TLR6, and CD14 showed that TLR6 and CD14 were also necessary for PGA-induced inflammatory responses. Furthermore, PGA-enhanced activation of mitogen-activated protein (MAP) kinases and nuclear factor-kappa B (NF-κB), were responsible for expression of proinflammatory cytokines. Additionally, PGA-induced TNF-α production was abrogated not only in MyD88-/- BMDMs but also in BMDMs pretreated with inhibitors of MAP kinases and NF-κB. These results suggested that immune responses induced by PGA occurred via TLR2, TLR6, CD14, and MyD88 through activation of MAP kinase and NF-κB pathways.


I. 들어가는 말

탄저균(Bacillus anthracis)은 치명적인 인수공통 감염병인 탄저를 유발하는 원인균으로, 미국 질병통제 및 예방센터(Centers for Disease Control and Prevention; CDC)에서 지정한 생물테러 병원체 중 가장 상위단계인 Tier1 select agent에 속하는 고위험 병원체이다[1]. 탄저균이 포자의 형태로 숙주에 감염되면, 포자는 먼저 대식세포나 수지상세포와 같은 항원제시세포에 의해 포식되어 가까운 림프절로 이동하고 발아하여 독소를 분비하는 영양세포가 된다[2]. 그 다음 영양세포는 혈액으로 나와 혈액 1 밀리리터 당 107-108에 이를 정도로 증식되고, 높은 농도의 외독소(exotoxin)를 분비하여 부종 및 세포사멸을 유도하게 된다[3].
외독소와 함께 중요한 탄저균의 병독성인자로는 탄저균의 외막을 둘러싸고 있는 Poly-γ-D-Glutamic Acid(PGA) 캡슐이 있으며, 포식작용(phagocytosis)을 억제하여 면역세포의 공격으로 부터 탄저균을 보호하는 역할을 한다고 알려져 있다[2]. 실제로 탄저균에 캡슐 분해효소를 처리할 경우 대식세포의 포식 능력 및 호중구에 의한 탄저균 사멸 능력이 증대된다고 보고되었다[4]. 또한 PGA는 탄저균 감염동물모델에서 치사독소(lethal toxin)와 결합된 형태로 존재함이 밝혀졌으며, 치사독소와 PGA를 대식세포에 동시 처리 시 세포사멸을 증대시킨다[5]. 이와 더불어 인간 대식세포 및 수지상세포에 PGA를 자극 시 전염증성 싸이토카인인 IL-1β의 발현을 유도할 수 있음이 보고되었다[6]. 하지만, PGA가 숙주 면역세포에 의해 어떻게 인식되고 면역반응을 유도하는 지에 대해서는 알려져 있지 않다.
본 글에서는 숙주 대식세포에서 PGA 캡슐이 어떠한 수용체 및 신호전달 경로를 통하여 면역세포의 활성화를 유도하는 지에 대하여 기술하고자 한다.


II. 몸 말

병원성 미생물이 숙주에 침입하게 되면, 대식세포와 수지상세포와 같은 선천성 면역세포는 toll-like receptors(TLR), nucleotide-binding oligomerization domain(NOD) receptors, RIG-I-like receptors( RLR) 등과 같은 패턴인식수용체(pattern-recognition receptors; PRR)를 통하여 침입한 미생물의 특이 분자 패턴(microbes-associated molecular patterns; MAMP)을 인식하고 선천성 면역반응을 유도함으로써 침입한 미생물에 대응하게 된다[7]. 이러한 인식수용체 중에서 TLR은 미생물의 다양한 특이 분자패턴을 인식하고 숙주의 면역체계를 활성화시킴으로써 침입한 미생물을 제거하는데 핵심적인 역할을 한다. 현재까지 포유동물에서 13종의 TLR이 확인되었으며, 각 수용체는 박테리아와 바이러스의 다양한 특이 분자패턴을 인식한다[8]. 이 중 TLR2는 peptidoglycans, lipoteichoic acid(LTA), lipoproteins와 mycobacteria의 lipoarabinomannan과 같은 박테리아의 다양한 물질을 인식한다[8]. 이와 같이 TLR2가 다양한 미생물의 분자패턴을 인식할 수 있는 이유는 TLR1 또는 TLR6와 heterodimer를 이루는 것과 연관되어 있다. LTA와 diacylated lipoproteins는 TLR2/TLR6를 활성화시키며, triacylated lipoproteins는 TLR1/TLR2를 활성화시킨다[8,9]. CD14는 glycophosphatidylinositol이 결합된 당단백질로 TLR2 리간드인 LTA와 lipoproteins를 포함한 다양한 TLR 리간드의 수용체 인식에 중요한 역할을 한다[8]. 리간드의 결합에 의해 활성화된 TLR2는 MyD88과 MAP(mitogen-activated protein) kinases 및 전염증성 싸이토카인의 발현에 중요한 역할을 하는 전사인자인 NF-κB(nuclear factor-kappa B)를 활성화 시킨다[8,9].
본 연구에서는 먼저 PGA가 숙주 면역세포의 활성화를 유도할 수 있는지를 알아보기 위하여 마우스 골수유래 대식세포(bone marrow-derived macrophages; BMDMs)에 PGA를 농도별로 처리하고 다양한 염증성 싸이토카인의 분비량 변화를 조사하였다. PGA는 대식세포에서 농도 의존적으로 TNF-α, IL-6, IL-12p40과 MCP-1의 분비를 유도함을 확인할 수 있었다(Figure 1).

PGA가 숙주 대식세포의 활성화를 유도할 수 있음을 확인하였으므로, 이 현상이 TLR 2 또는 4를 통하여 일어나는 지를 조사하였다. 이를 위하여 TLR2/CD14 또는 TLR4/CD14를 발현하고 NF-κB 프로모터의 조절아래 인간 CD25 유전자를 발현하는 chinese hamster ovary(CHO) 세포에 각각 PGA를 18시간 처리한 후 유세포분석기를 이용하여 CD25 유전자의 발현변화를 조사하였다. PGA는 TLR2/CD14를 발현하는 세포에서는 CD25의 발현을 증가시켰으나, TLR4/CD14를 발현하는 세포에서는 CD25의 발현 증가를 유도하지 못함을 확인할 수 있었다(Figure 2A). 이와 더불어 TLR2를 보유하고 있는 대식세포에서 PGA는 TNF-α와 IL-6의 분비를 유도하였으나(Figure 2B, C), TLR2가 결손된 대식세포에서는 TNF-α와 IL-6의 분비를 유도하지 못하였다. 이와 달리 PGA는 TLR4의 결손유무와 상관없이 대식세포에서 TNF-α와 IL-6의 분비를 유도하였다(Figure 2D, E). 따라서 이러한 결과들을 종합해 볼 때 숙주 세포에서 PGA는 TLR4가 아닌 TLR2 수용체에 의해 인식됨을 확인하였다.
TLR2는 다른 TLR과 달리 TLR1 또는 TLR6와 heterodimer를 이루어 다양한 병원성 미생물의 분자패턴을 인식하는 것으로 알려져 있다[9]. 따라서 TLR1/TLR2 또는 TLR2/TLR6 중 어떠한 수용체가 PGA를 인식할 수 있는 지를 세포 내에 자체적으로 TLR1과 TLR6를 발현하고 있는 HEK293-TLR2 세포를 이용하여 조사하였다(Figure 3A). HEK293-TLR2 세포에 TLR1, TLR6, TLR2의 기능을 억제할 수 있는 중화항체와 대조군으로 IgG1을 1시간 전 처리한 후 TLR1/TLR2 리간드인 PAM3CSK4(P3C)와 TLR2/TLR6 리간드인 MALP2 그리고 PGA를 24시간 동안 처리한 후 세포에서 IL-8의 분비량을 조사하였다(Figure 3A). PGA는 HEK293-TLR2 세포에서 IL-8의 분비를 유도하였으며, 이러한 효과는 TLR2 또는 TLR6에 대한 중화항체를 1시간 전 처리 하였을 경우 억제됨을 확인할 수 있었다. 이와 달리 TLR1 중화항체 전 처리 시에는 IL-8의 분비량의 변화가 없음을 확인할 수 있었다. TLR6가 PGA의 수용체임을 좀 더 명확히 확인하기 위하여, TLR1/TLR2, TLR2, TLR2/TLR6를 과발현하고 있는 HEK293 세포에 PGA, P3C, MALP2를 24시간 동안 처리하고 세포에서의 IL-8 분비량을 조사하였다(Figure 3B). TLR2 리간드인 P3C와 MALP2는 TLR2 세포와 비교했을 때 각각 TLR1/TLR2와 TLR2/TLR6를 과발현하고있는 세포에서 IL-8의 분비를 증가시킴을 확인할 수 있었다. PGA의 경우에는 TLR1/TLR2 세포가 아닌 TLR2/TLR6를 과발현하는 세포에서만 특이적으로 IL-8의 분비를 증가시켰다. 이러한 결과들을 종합해볼 때, PGA는 TLR2/TLR6를 통하여 면역반응을 유도함을 확인할 수 있었다.

CD14는 TLR2에 의한 면역반응에 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있으므로[9], PGA에 의해 유도되는 면역반응에 CD14가 관여하는지를 알아보았다(Figure 4). CHO/TLR2/CD14 세포에 IgG1 또는 CD14 중화항체를 1시간 전 처리하고 PGA와 LTA를 18시간 동안 처리하였다(Figure 4A). PGA와 LTA는 모두 CHO/TLR2/CD14 세포에서 CD25의 발현을 증가시켰으며, CD14 중화항체 전 처리에 의해 이러한 효과가 억제되는 것을 확인하였다. 이와 더불어, HEK293-TLR2 세포에 PGA와 LTA를 단독 처리할 경우 보다 CD14 단백질을 함께 처리할 경우 IL-8의 분비가 증가됨을 확인할 수 있었다(Figure 4B). 또한 HEK293-TLR2 세포에 CD14 유전자를 과발현 시키고 PGA와 LTA를 처리할 경우 PGA와 LTA에 의해 유도되는 NF-κB의 활성화가 증가됨을 확인하였다(Figure 4C). 이러한 결과들을 종합해볼 때 PGA에 의해 유도되는 면역반응에 CD14가 관여함을 확인할 수 있었다.
TLR2를 통한 면역반응에 MyD88, MAP kinases, NF-κB 신호분자들이 관여하는 것이 알려져 있으므로[9], PGA에 의한 면역반응에 이들 신호분자들이 관여하는지를 조사하였다(Figure 5). 먼저 MyD88을 보유한 대식세포에서 PGA에 의해 유도된 TNF-α의 분비가 MyD88이 결손된 대식세포에서는 유도되지 않음을 확인할 수 있었다(Figure 5A). 또한 TLR2를 보유한 대식세포에서 PGA에 의해 유도된 ERK, JNK, p38 MAP kinases의 인산화가 TLR2가 결손된 대식세포에서는 유도되지 않았으며(Figure 5B), PGA에 의해 유도된 TNF-α의 분비는 ERK, JNK, p38 MAP kinases 저해제에 의해 억제되었다(Figure 5C). 그 다음으로 PGA 자극에 의한 NF-κB 전사인자의 활성화를 조사하였다. 대식세포를 PGA 자극 시 활성화된 NF-κB 전사인자가 핵으로 이동하는 것을 억제하는 단백질인 I-κB-α의 분해를 유도하였으며(Figure 5D), 이와 함께 NF-κB p65 단백질의 핵으로의 이동을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다(Figure 5E). 또한 대식세포에서 PGA에 의해 유도된 TNF-α의 분비가 NF-κB 저해제인 parthenolide에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다(Figure 5F). 이러한 결과들을 종합해볼 때 대식세포에서 PGA는 MyD88, MAP kinases, NF-κB 신호전달경로를 통하여 면역반응을 유도함을 알 수 있었다.


III. 맺는 말

본 연구에서는 숙주 면역세포의 포식작용을 억제함으로써 탄저 병인기전에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PGA 캡슐이 TLR2, TLR6와 CD14를 통하여 인식되어 숙주 면역세포를 활성화시키고, 이를 통하여 염증성 싸이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-12p40 및 MCP-1의 분비를 유도할 수 있음을 확인하였다. 또한 PGA에 의한 면역세포의 활성화는 MyD88, MAP kinases, NF-κB 신호 전달체계를 통하여 이루어짐을 증명하였다. 본 연구 결과는 탄저 병인기전의 이해 및 탄저 치료제 개발을 위한 기반자료로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.


Ⅳ. 참고문헌

1. Morse, S. A. 2015. Pathogen security-help or hindrance? Front. Bioeng. Biotechnol. 2:83
2. Liu, S. et al., 2014. Anthrax lethal and edema toxins in anthrax pathogenesis. Trends Microbiol.22:317-325.
3. Jeon J. H. et al., 2014. Bacillus anthracis genomic DNA enhances lethal toxin-induced cytotoxicity through TNF-α production. BMC microbiol. 14:300
4. Scorpio, A. et al., 2008. Treatment of experimental anthrax with recombinant capsule depolymerase. Antimicrob. Agents Chemother. 52:1014-1020.
5. Jang, J. et al., 2013. Monoclonal antibody against the poly-gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis protects mice from enhanced lethal toxin activity due to capsule and anthrax spore challenge. Biochim. Biophys. Acta 1830: 2804-2812.
6. Cho, M. H. et al., 2010. Bacillus anthracis capsule activates caspase-1 and induces interleukin-1beta release from differentiated THP-1 and human monocyte-derived dendritic cells. Infect. Immun. 78:387-392.
7. Mogensen, T. H. 2009. Pathogen recognition and inflammatory signaling in innate immune defenses. Clin. Microbiol. Rev. 22:240-273
8. Moresco, E. M. et al., 2011. Toll-like receptors. Curr. Biol. 21:R488-493.
9. Farhat, K. et al., 2008. Heterodimerization of TLR2 with TLR1 or TLR6 expands the ligand spectrum but does not lead to differential signaling. J. Leukoc. Biol. 83:692-701.