약독화 백시니아 바이러스주 KVAC103을 이용한 백신전달체 개발

Abstract

BACKGROUND: KVAC103 is a highly attenuated vaccinia virus strain, developed for third-generation smallpox vaccine at the Korean National Institute of Health (KNIH). It is created through multiple propagations and plaque isolation of conventional smallpox vaccine strain of vaccinia virus in Vero cells. It has a 19.5-kb deletion in the left wing of the genome and can replicate only in restricted mammalian cell lines. Using KVAC103, we constructed a recombinant viral vector for preventive and therapeutic vaccines.
METHODOLOGY: To improve the replication of the virus and develop efficient recombinant virus production methods, the plasmid shuttle vectors, containing C7L or K1L, were constructed and tested for recombinant virus production.
RESULTS: Using the plasmid shuttle vectors containing these genes, the recombinant viruses from KVAC103 strain were easily obtained. The recombinant viruses replicated efficiently in diverse mammalian cell lines and expressed higher levels of GFP antigens.
CONCLUSION: Recombinant KVAC103 vaccinia virus can be used as a unique viral vector to overcome the difficulties in developing vaccines against some infectious diseases and cancers by inducing effective humoral and cellular immune responses. Additionally, this method may be used for rapid vaccine development against threatening outbreaks


Ⅰ. 들어가는 말

백시니아 바이러스는 예로부터 두창(천연두)의 예방백신으로 이용되어 왔으며 살아있는 바이러스를 체내에 접종하여 강력하고 다양한 체액성 및 세포매개성 면역반응를 유도함으로서 두창 박멸에 크게 기여한 바 있다[1]. 1980년 세계보건기구(WHO)의 두창박멸 선언 이후 더 이상 생산과 접종이 필요 없게 되었으나 2000년대 들어, 탄저에 의한 미국의 대규모 피해 사례 등을 통해 두창의 생물테러 무기 사용 가능성이 높아지면서 두창백신의 필요성이 크게 대두되었다. 하지만 야생형 백시니아를 사용하는 기존의 대동물체내에서 증식한 1세대 백신이나 비약독화 세포배양 2세대 백신은 염증유발 등 여러 가지 부작용으로 특히, 면역저하자, 노약자, 임산부 등 특정인들에게 사용이 제한될 수 있다는 단점이 있어 미국 등 선진국에서는 이를 극복하기 위한 차세대 두창백신 개발에 많은 노력을 기울이고 있다.
백시니아 바이러스는 두창백신으로서 뿐만 아니라 백신전달체로서 주목받고 있는데 비교적 큰 (약 180kb) 선형 DNA 게놈을 가지고 있어 여러 가지 항원 유전자를 탑재할 수 있다. 또한 강력한 면역유발 능력을 가지고 있어 개발이 어려운 감염병 치료 및 예방 백신, 항암백신 등을 위한 백신전달체로서 사용 될 수 있으며 약독화 백시니아 바이러스에 외래 유전자를 삽입하면 더욱 안전하고 부작용이 적은 재조합 백신을 만들 수 있다.
질병관리본부는 자체연구를 통해 3세대 약독화 두창백신 후보주 KVAC103을 개발하였으며 진행하고 있다. 본 글에서는 약독화 백시니아 바이러스인 KVAC103을 이용한 백신전달체 개발 연구에 대해 소개하고자 한다.


Ⅱ. 몸 말

KVAC103은 과거 두창 백신용으로 생산된 백시니아 바이러스를 원숭이 신장유래의 베로(vero) 세포에서 103회 이상 계대후 단일 플라크를 2회 분리하여 얻은 것으로, 토끼의 피부에 접종 했을 때 기존 백신주에 비해 극히 적은 피부염증 반응을 보였으며, 5일령 신생마우스 뇌에 접종한 생존 실험에서도 독성이 현저히 감소된 특징을 나타내었다. KVAC103은 기존백신주에 비해 숙주세포가 제한적이고, Vero 세포에서는 낮은 혈청 농도에서 증식이 되는 특징이 있으며 비교적 작은 크기의 플라크를 형성한다. KVAC103의 전체게놈 염기서열 분석을 통해 좌측날개에서 19.5kb 영역과 우측날개에서 2.5kb 영역이 deletion 되어 있으며 이것이 본 바이러스의 약독화 특성에 기여하는 것을 확인하였다(Figure 1). 이를 활용하여, 약독화 백시니아 바이러스 KVAC103을 모바이러스로, 외래 항원 유전자를 삽입함으로서 안전성이 뛰어나고 재조합 효율이 높은 백신전달체를 개발하기 위한 연구를 수행하였다.

재조합 백시니아 바이러스를 만들기 위하여, 먼저 TK 부위에 상동재조합으로 외래유전자를 삽입할 수 있는 플라스미드 전달벡터를 고안하였다. 이 전달벡터는 상동재조합에 필요한 TK부위의 좌측 및 우측 염기서열, 강력한 early-to-late 프로모터, 녹색형광단백질(GFP) 유전자, 그리고 백시니아 바이러스의 숙주영역 유전자(host range gene)인 C7L 또는 K1L을 포함하였다. C7L과 K1L은 interferon antagonist로 작용하는 숙주영역유전자로서 원래 야생형 백시니아의 좌측날개에 존재했던 유전자인데 KVAC103의 경우 약독화 과정에서 deletion 된 것이다. 야생형 백시니아 바이러스에 외래유전자를 삽입하는 경우 재조합 바이러스의 비율은 통상 0.1∼1% 정도로 낮지만, pVVT1을 이용한 숙주영역 유전자를 삽입한 이 플라스미드 전달벡터를 KVAC103에 적용하면 100% 가까운 높은 비율로 재조합 바이러스를 얻을 수 있었다(Figure 2). 이 유전자를 다시 플라스미드 전달벡터에 삽입한 결과 외래 유전자의 재조합 효율이 극적으로 향상되었다.

녹색형광단백질이 삽입된 KVAC103 유래의 3가지 재조합 바이러스들을 5종의 포유동물 유래의 세포주(143B, Vero, BSC-40, MA-104, RK-13)에 감염시키고 증식성을 비교한 결과, 숙주영역유전자 C7L 또는 K1L이 삽입된 재조합 바이러스는 대부분의 세포에서 KVAC103-GFP에 비해 증식성이 향상되었다는 것을 플라크 형성양성(크기 등)을 통해 확인할 수 있었다(Figure 3). 또한, 토끼의 피부에 기존 사용중인 Lister 백신주와 재조합 바이러스를 접종하여 피부독성을 비교한 결과, 모 바이러스인 KVAC103-GFP와 C7L이 삽입된 바이러스는 Lsiter에 비해 피부독성반응이 거의 없었으며, K1L이 삽입된 바이러스는 피부독성이 다소 증가하였으나 야생형의 Lister-GFP에 비해서 독성이 약한 것으로 확인되었다(Figure 4).


Ⅲ. 맺는 말

최근, MVA(Modified Vaccinia Ankara) 등 약차세대 두창백신주를 이용한 감염병 예방백신 및 암치료 백신의 개발 연구가 활발히 진행되고 있다. 질병관리본부에서는 본 연구를 통해 개발된 재조합 기술을 사용하여 외래항원이 삽입된 재조합 백시니아 바이러스 획득 가능성을 높일 수 있었다. 제작된 재조합 바이러스는 체내의 다양한 면역기전을 자극함으로서 탑재된 특정항원의 면역능 유도를 위한 효과적인 백신전달체로서 역할을 수행할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 연구결과인 모 바이러스주 KVAC103에 대한 특허[2]와 재조합 백신전달체 기술에 관한 특허[3]의 국내등록이 완료되었으며, 현재 이를 기반으로 차세대결핵백신, 탄저-두창백신, 그리고 지카바이러스 예방백신 등의 다양한 재조합 백신 개발 연구를 수행하고 있다. 향후 지속적인 연구를 통해 결핵, C형간염, 치료용 암백신 등 개발이 어려운 백신분야[4,5]와 전 세계적인 감염병 대유행 상황에 신속하게 대응하기 위한 백신 플랫폼으로 적극 활용할 예정이다.


Ⅳ. 참고문헌

1. Fenner, F. et al. Smallpox and its eradication. WHO(Geneva), 1988
2. "약독화 백시니아 바이러스주 KVAC103" 특허등록 제10-2014-0140150호, 질병관리본부
3. “KVAC103 유래의 재조합 백시니아 바이러스” 특허등록 제 10-2014-0140151호, 질병관리본부
4. Gómez CE, José L. et al. The Poxvirus Vectors MVA and NYVAC as Gene Delivery Systems for Vaccination Against Infectious Diseases and Cancer. Current Gene Therapy, 2008, 8(2):97-120.
5. Arwen F. Altenburg. et al. Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) as Production Platform for Vaccines against Influenza and Other Viral Respiratory Diseases. Viruses 2014, 6:2735-61