면역자기비드 분리 방법을 이용한 장출혈성대장균 분리

BACKGROUND: To isolate bacterial pathogens from environments, foods, or clinical specimens, we commonly apply methods that utilize selective media or antimicrobial resistance. Even so, these methods cannot completely isolate pathogenic bacteria from commensal bacteria. In addition, these classical techniques require a lot of time, cost, and effort for the separation of pathogenic bacteria.
METHODOLOGY/RESULTS: This study attempted to isolated Shiga Toxin-producing Escherichia coli (STEC) using the Immunomagnetic Separation (IMS) method. Monoclonal antibodies of Shiga toxin 1 and 2, which were excreted by STEC, were produced and then attached to the magnetic beads. Afterwards, STEC isolation from non-pathogenic E. coli was examined. In terms of detection limit, isolation ratio was higher than 80% at 102 CFU . But 1~10 CFU of STEC could not be isolated. The isolation ratio of STEC from other enteric pathogens (Salmonella, Vibrio spp., Shigella spp., EIEC, EPEC and ETEC) was higher than 80% on average. In particular, E. coli O157:H7 strain EDL933 was isolated by over 90%. These findings demonstrated that a magnetic bead-based method is effective in isolating pathogenic microorganisms.
CONCLUSION: The process described above resulted on the effective isolation of the pathogenic bacteria through the IMS method. In addition, it would be helpful in preventing the spread of the bacteria through the reduction of diagnosis time for pathogenic bacteria.



Ⅰ. 들어가는 말

장출혈성대장균 감염증(EHEC, Enterohemorrhagic E. coli or STEC, Shiga toxin producing E. coli)은 1982년 미국에서 덜 익은 햄버거에 의한 혈성설사를 보이는 진단환자들에서 처음으로 분리되어 알려졌다[1]. 당시 분리되었던 균주는 E. coli O157:H7 이었고 같은 해에 용혈성요독증후군(HUS, hemolytic uremic syndrome)과 E. coli가 관련 있음이 보고되었다. 장출혈성대장균의 배양액은 신장의 Vero 세포에 독성을 나타내어 Vero 독소로 불리며, Shigella dysenteriae 1의 쉬가 독소의 항혈청으로 대장균 배양액의 독성이 제거 된다는 사실이 밝혀짐에 따라 이 Vero 독소와 Shiga-like toxin (Stx)이 같은 독성인자임이 확인되었다[2]. 이 쉬가 독소는 배양액에서 볼 수 있는 분비 독소로 잘 알려져 있으나, 분비되는 독소만큼 병원체의 외막 lipopolysaccharide층에 존재하는 것으로 최근 보고되었다.
2011년 독일에서 시작된 O104:H4의 감염은 주변 국가들에서 동시 다발적으로 발생하여 4,000여명의 감염자가 발생하였으며, 그 중 900여명이 용혈성요독증후군으로 진행이 되고 54명의 사망자가 발생하였다[3]. 국내의 경우 1998년 첫 환자가 보고된 이후 1999년 2례, 2000년 3례, 2001년 11례, 2002년 8례가 보고되었으며, 최근 들어 매년 50여건의 환자가 발생하고 있다[4].
장출혈성대장균의 진단은 전통적으로 설사 환자의 분변을 전 배양 후 MacConkey 한천배지에 배양하여 각각의 집락을 선별하여 PCR 방법으로 쉬가 독소 유전자의 유무를 판별한다. 그러나 이 방법은 최소 3∼7일의 검사 기간이 필요하며, 한 환자의 검체로부터 장출혈성 대장균을 분리하기 위한 비용 및 인력이 많이 소모되는 방법이다. 이러한 시간, 인력, 비용은 대변 검체내의 비병원성 대장균과 병원성 대장균의 감별 방법의 어려움으로 인해 발생하고 있다.
면역자기비드 분리 방법(IMS, Immunomagnetic separation)을 이용한 검출방법은 검체 내 원하는 병원체만을 선택적으로 농축하고 다른 세균을 효과적으로 제거할 수 있는 방법으로 알려져 있다[5,6]. 이 방법은 외막에 존재하는 쉬가 독소에 대한 단클론항체를 면역자기비드(immuno-magnetic bead)에 부착하여, 전 배양 단계에 첨가하면 장출혈성대장균에 특이적으로 결합을 하여, 비병원성대장균으로부터 선별적으로 분리할 수 있다. 이에 대하여 간략하게 소개하고자 한다.


Ⅱ. 몸 말

1. 쉬가 독소 항원에 대하여 단클론항체 제작
쉬가 독소 유전자의 합성을 위하여 각각의 쉬가 독소를 분비하는 장출혈성대장균(EDL933, O157: H7)을 주형으로 PCR 증폭을 하여 쉬가 독소 유전자를 합성하였고 증폭된 DNA는 발현벡터에 클로닝 한 후 염기서열을 분석하여 삽입된 유전자의 서열이 본래의 서열과 일치함을 확인하였다. 서열이 확인된 클론은 단백질 발현 및 정제하여 단클론항체를 제작하기 위한 항원으로 활용하였다. 정제된 Stx 1 과 Stx 2 A-subunit을 마우스에 면역 후 매 2주마다 항원을 재투여하였다. 이 후 spleen cell과 myeloma cell line을 fusion 후 배양하였다. 항체를 생산하는 cell line을 Immunoblot으로 확인하였다(Figure 1A).
Stx1 및 Stx2에 대한 복수액을 생산하여, STEC (EDL933)의 단백질과의 교차반응을 확인하였다. 그 결과, Figure 1B에서와 같이 STEC의 전체 단백질 중 Stx1과 Stx2에만 반응하고 약 28 kDa 단백질과 교차반응이 확인되었다. 외막의 단백질을 정제 후 Immunoblot한 결과 외막 단백질들과는 교차 반응이 없었으며(Figure 1B), O111, O91 혈청형의 STEC 독소와 반응을 확인하였다(Figure 1C).

2. Protein G & protein A magnetic bead의 항체 부착능 확인
면역자기비드에 항체를 부착하기 위한 최적의 시간 조건을 확인하기 위해 100 μg의 항체와 protein G 비드와 protein A 비드를 각각 시간 별로 4℃에서 반응시킨 후 비드에 부착하지 못한 항체의 단백질량을 정량하였다(Figure 2). 그 결과 4시간 부착 후 50%의 항체가 비드에 부착하였다. Protein G 비드는 4시간까지 부착이 완만하게 이루어지나, 4시간 이후로는 protein A에 비해 5∼10%정도 높은 부착효율이 보였다(Figure 2). 이 결과를 종합해 볼 때 자성나노비드와 항체를 4℃에서 8시간 부착하는 조건에서 가장 많은 항체가 부착하였다.

3. Stx1 producing E. coli & Stx2 producing E. coli의 선별분리 확인
STEC (105 CFU)와 비병원성대장균(108 CFU)을 혼합 후 마그네틱 비드-항체 복합체를 이용해 시간별로 균 분리를 확인하였다. STEC (Stx1)의 경우 8시간 반응하였을 경우 가장 좋은 분리율을 보였으나(Figure 3A), STEC (Stx2)는 4시간 반응에서 가장 좋은 결과를 보였다(Figure 3B). 하지만 1시간 미만의 반응 시간 만으로도 STEC 분리가 가능한 것을 확인하였다.

4. 비병원성 대장균 및 다른 식중독균 혼합 샘플에서의 EHEC 분리
Salmonella Typhimurium, Vibrio cholera O1, Shigella sonnei, 비병원성 대장균과 교차반응을 확인하였다. 혼합 샘플에서 EHEC 분리율을 확인하고자 EHEC 105 CFU와 다른 세균 108 CFU을 혼합 후 실험에 사용하였다.
실험 결과, STEC와 9주의 비병원성대장균, 다른 식중독균들과 선별 분리율이 평균 80% 이상인 것을 확인하였다. 그러나 결과 중 비브리오 균과의 혼합 샘플에서 STEC 분리율이 60%대로 약간 감소하는 결과를 보였다(Figure 4). 이는 비브리오 독소도 AB5 toxin family로 Stx1 & 2와 유사한 구조로 알려져 있어 약간의 교차반응이 있는 것으로 여겨진다. 특히 O157의 경우 모든 90%이상의 분리율을 보여 다른 STEC보다 약간 분리율이 높은 것을 확인하였다. 그러나 이 결과가 O157이 쉬가 독소를 다른 균주보다 많이 생산하기 때문인지에 대한 원인은 추후 연구를 진행하며 확인하고자 한다.
RPLA (Reverse passive latex agglutination) 음성인 균주를 대상으로 분리를 확인한 결과 RPLA 양성 균주에 비해 분리율이 현저히 감소하였다(Figure 4). Stx1 producing STEC의 경우 편차가 있기는 하지만 STEC가 모두 분리되었으나, Stx2 producing STEC는 5개의 샘플에서 STEC 분리에 실패하였다. 이는 RPLA 방법으로는 확인이 불가능한 균주의 경우에도 미량의 독소가 분비되는 것을 의미하며 일부 균을 제외하고 병원체 분리가 가능함을 의미한다.

5. Direct PCR과 IMS PCR 비교
장출혈성대장균 환자 발생 시 검체를 대상으로 유전학적 검사를 통해 감염 여부를 확인함으로써 신속한 진단을 통해 감염 확산을 조기에 차단 할 수 있다. 그러나 환자 검체에는 유전학적 진단에 저해 요소가 되는 많은 저해제가 존재하여 유전학적 진단에 어려움이 있다. 이에 본 연구에서는 면역자기비드를 이용해 유전학적 진단 저해제를 효율적으로 제거하여 환자 검체에서 빠른 시간내에 유전학적 진단 효율을 높일 수 있는지 여부를 확인하였다. 환자 검체의 수집에 어려움이 있어 정상인의 검체 1,000 ㎕에 STEC를 1∼105 CFU를 첨가한 샘플을 대상으로 직접 유전학적 진단(Direct PCR)을 하는 것과 면역자기비드를 이용해 STEC를 분리 후 유전학적 진단 방법(IMS PCR)을 비교하였다. Figure 5에서와 같이 EDL933의 경우 Direct PCR의 경우 104 CFU까지 양성을 보인 반면 IMS PCR의 경우 101 CFU까지 양성임을 확인할 수 있었다(Figure 5). 다른 혈청형의 경우에도 약 10∼1,000배의 검출한계가 증가하는 결과를 확인하였다. 이 결과는 본 연구에서 개발된 진단법이 저해제를 효과적으로 제거하고 STEC를 선별적으로 농축함으로써 유전학적 진단의 민감도를 증가시킬 수 있는 것으로 평가되었다.

6. IMS 방법을 이용한 STEC 선별분리
본 연구에 개발된 진단 방법으로 O157:H7 균을 선별 분리를 기존 방법과 비교하였다. O157:H7은 sorbitol 분해능이 없어 SMac 배지에서 colorless로 비병원성 대장균과 구별이 되어 본 실험에 사용하였다. 대변 검체 1,000 ㎕에 105 CFU를 첨가 후 기존의 방법으로 37도에서 18시간 전 배양 후 SMac 한천 배지에 배양한 결과 Figure 6에서와 같이 약 13개의 집락이 O157:H7로 확인 동정하였다. 그러나 IMS 방법으로 전 배양 시간 30분 동안 면역자기비드를 첨가하여 균을 SMac 한천배지에 배양한 경우 빨간색 집락(비병원성 대장균)은 현저히 감소하고, O157:H7 (colonless 집락)은 300개 이상의 집락이 성별 분리 되는 것을 확인 하였다(Figure 6).


Ⅲ. 맺는 말

본 연구에서는 분변시료 등에서 장출혈성대장균을 신속하게 선별·분리할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 면역자기비드를 이용한 방법을 고안하였다. 이를 위해 장출혈성대장균에 특이적인 유전자인 쉬가 독소를 표적으로 정하였고, 재조합 쉬가 독소를 과 발현·정제하여 단클론항체를 제작하였다. 쉬가 독소 단클론항체와 결합되어있는 면역자기비드는 분변시료에서 장출혈성대장균을 효과적으로 선별하여 농축 시키고, 유전학적 진단 저해제를 제거함으로써 진단에 들이는 시간, 인력, 비용 등을 획기적으로 줄일 수 있을 것으로 기대된다. 또한 이 면역자기비드를 이용한 방법을 다른 세균 및 바이러스의 진단에 적용한다면 진단에 들이는 시간과 비용을 크게 줄일 수 있을 것으로 기대된다.


Ⅳ. 참고문헌

1. Rjan Olsvik, Tanja Popovic, Eystein Skjerve, Kofitsyo S. Cudjoe, Erik Hornes, John Ugelstad, and Mathias Uhlen. 1994. Magnetic Separation Techniques in Diagnostic Microbiology, Clin. Micr. Review 7:43-54.
2. Nakao H, Kataoka C, Kiyokawa N, Fujimoto J, Yamasaki S, Takeda T. 2002. Monoclonal antibody to shiga toxin 1, which blocks receptor binding and neutralizes cytotoxicity. Microbiol Immunol. 46(11):777-80.
3. Karch H. et al. 2012. The enemy within us; Iessonsfrom the 2011 European Escherichia coli O104:H4 outbreak. EMBO Mol Med. 4(9):841-8.
4. www.enternet.kr.
5. Hongwei Gu, Keming Xu, Chenjie Xu and Bing Xu. 2006. Biofunctional magnetic nanoparticles for protein separation and pathogen detection, Chem. Commun., 941-949.
6. Salgueirino-Maceira V., Correa-Duarte M. A., Spasova M., Liz-Marzan L. M., Farle. M. 2006. Composite Silica Spheres with Magnetic and Luminescent Functionalities, Adv. Funct. Mater., 16:509-514.