Abstract

BACKGROUND: Since RhD antigens are highly immunogenic, RhD negative patients should receive RhD negative blood to prevent adverse reaction. Among the RhD variants, the DEL type expresses extremely low D antigens on red blood cells due to mutation of the RHD gene that shows RhD negative results in serologic testing while D antigen is identified in RHD genotyping. Recently, some cases have been reported where anti-D has been induced after being transfused with serological RhD negative blood later identified as DEL type during further investigation (including genotyping). Therefore, we need to prepare an alternative strategy for these cases and in this study, we propose a new safe transfusion strategy for Korean RhD negative patients.
METHODOLOGY: We reviewed cases that induced anti-D by transfusion of DEL type blood and performed RhD typing, weak D testing, Rh C,c,E,e phenotyping and RHD genotyping in 110 samples collected from members of the Gwangju-Jeonnam RhD negative blood donor club. We also conducted a survey among experts about safe transfusion plans for RhD negative patients.
RESULTS/CONCLUSION: In Korea, three cases have been reported in which anti-D was induced in RhD negative recipients due to transfusion of RBCs from Asian DEL type donors. Of the 110 samples, 16 samples were classified as DEL type, and most of them (n=14) were categorized as Asian DEL type. Particularly, 58 samples with ccee phenotype were identified as true RhD negative that has total deletion of RHD gene. In the hospitals, they should diagnose DEL type patients and prepare alternatives in the event of RhD negative blood shortage, such as selective transfusion plans considering high-risk group. In the future, we will continue to establish policies regarding donors and recipients of the DEL type.


들어가는 말

사람의 적혈구에는 500개 이상의 적혈구 항원들이 존재하며, 항원의 종류에 따라 혈액형이 결정된다. 각각의 적혈구 항원은 해당하는 유전자에 따라 결정되며, 인종별로 차이가 발생한다. 대다수의 적혈구 항원은 면역원성이 낮아 수혈 시 임상적으로 문제가 되지 않지만, ABO, RhD 혈액형은 항원의 면역원성이 강해 정확한 검사에 따른 수혈이 필요하다. RhD 음성인 사람은 RhD 양성 혈액의 수혈이나 RhD 양성 아이의 임신으로 RhD 항원에 노출되면 항-D가 생성될 확률이 높기 때문에 RhD 항원에 노출되지 않아야 한다. 만약, RhD 항원에 노출로 인해 항-D가 생성되면 향후 용혈성수혈반응이나 태아신생아용혈성질환 등 심각한 부작용이 발생할 수 있다. 따라서 RhD 음성자는 RhD 음성 혈액을 수혈 받아야하고, RhD 양성 아이를 임신하면 Rh 면역글로불린(RhIG)을 투여하여 RhD 항원 노출을 최대한 예방해야 한다[1].
그런데 최근 RhD 음성 혈액제제를 수혈 받은 RhD 음성 환자에게 수혈 후 항-D가 생성된 사례가 국내외로 보고되고 있다[2,3]. 그 원인은 수혈한 RhD 음성 혈액제제가 혈청학적 검사로는 RhD 음성이나 실제로는 RhD 변이형의 일종인 DEL형이기 때문이었다. DEL형은 RHD 유전자 변이로 적혈구 표면에 극소량의 RhD 항원이 발현되는 것이 특징이다. 따라서 기존 혈청학적 검사법으로는 RhD 음성으로 분류되지만 흡착·해리시험이나 RHD 유전자 검사와 같은 특수검사를 실시하여야 확인할 수 있다[4].
한국인에서는 RhD 음성(전체인구 중, 약 0.1%)으로 분류된 혈액 중 13~17%가 DEL형으로 보고된 바 있다[5,6]. DEL형은 인종에 따라 유전자 변이와 빈도가 다양한데, RHD(K409K, 1227G>A) 대립유전자를 가지는 Asia type DEL형은 한국인을 포함한 동아시아인에서 가장 흔한 DEL형이다[4]. 과거에는 DEL형과 같이 RhD 항원수가 적은 혈액은 RhD 음성자에게 수혈되어도 대부분의 경우 항-D 생성을 유발하지 않는다고 여겨왔으나 현재는 DEL형으로 인한 항-D 생성 사례가 지속적으로 보고되어, RhD 음성 수혈자의 안전을 위해 헌혈혈액과 수혈자에서 순수 RhD 음성과 DEL형을 정확히 구별할 수 있는 새로운 RhD 검사체계와 수혈정책이 요구되고 있다.
본 연구에서는 국내 DEL형 혈액제제가 수혈된 사례를 검토하고 RhD 음성자의 RhD 변이형 조사와 전문가 설문조사 결과를 종합하여 RhD 음성자의 수혈 안전을 확보하기 위한 새로운 RhD 혈액형 검사방안과 수혈정책을 제시하고자 한다.


몸말

국내 DEL형 혈액제제 수혈 후 항-D 발생 보고 사례

국내에서 RhD 음성 환자에게 RhD 음성 혈액제제 수혈 후 항-D가 발생한 사례를 조사하였다. 3건의 보고가 있었는데, 모든 예가 DEL형 혈액제제의 수혈 때문인 것으로 확인되었다(Table 1). 기존 혈청학적 검사로는 DEL형을 검출할 수 없었기 때문에 항-D 발생 원인규명을 위해 RHD 유전자 검사를 실시하여 이들 DEL형을 확인할 수 있었다. 1예는 68세 RhD 음성 환자(남성)가 복부대동맥 수술 중 RhD 음성 적혈구제제 4단위를 수혈 받았으며, 이후 항-D가 확인되었고 조사결과 1단위의 혈액이 Asia type DEL형(K409K, 1227G>A)으로 밝혀졌다[2]. 2예는 64세 RhD 음성 환자(남성, 러시아국적)가 전립선암 수술 중 RhD 음성 적혈구제제 2단위를 수혈 받았으며, 이후 항-D가 확인되었고 조사결과 2단위 모두 Asia type DEL형으로 밝혀졌다[7]. 3예는 54세 RhD 음성 환자(여성)가 RhD 음성 적혈구제제 2단위를 수혈 받았으며, 이후 항-D가 확인되었고 조사결과 1단위의 혈액이 Asia type DEL형으로 밝혀졌다[8].

RhD 음성자 중 RhD 변이형 조사

광주/전남 RhD 음성 봉사회 회원 110명의 검체를 확보하여 혈청학적 검사 및 RHD 유전자 검사로 RhD 변이형을 조사하였다.
혈청학적 검사로는 RhD 항원검사, 약-D검사, Rh 아형(C/c/E/e) 표현형검사를 실시하였다. RhD 항원검사와 약-D검사는 human IgG/IgM Monoclonal anti-D (Millipore, UK)와 monoclonal-polyclonal blend anti-D(Bioclone, clone MAD2, Ortho Clinical Diagnostics, USA)를 이용하였으며, Rh 아형(C/c/E/e) 표현형검사는 immediate-spin tube test with monoclonal anti-C, -c, -E, -e (Ortho Clinical Diagnostics, High Wycombe UK)를 이용하였다. RHD 유전자 검사는 QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 전혈에서 genomic DNA를 추출한 후 RHD 유전자의 promoter, intron 4, exon 7, exon 10 부위를 증폭시켜 Light Cycler System(Roche)로 해당 부위의 유무를 분석하였다. RHD 유전자의 exon 9를 직접염기서열 분석하여 RHD(W408R, 1222T>C)와 RHD(K409K, 1227G>A) 변이를 확인하였다. PCR 증폭산물을 PCR Clean Up-M System(Viogene)을 이용하여 DNA를 정제한 후 AmpliCycle Sequencing kit(Perkin-Elmer, NY)와 ABI 3130 sequencer(Applied Biosystems)를 이용하여 염기서열분석을 진행하였고 결과분석은 SEQUENCHER software(Gene codes Corporation, USA)를 사용하였다. RHD(W408R, 1222T>C)와 RHD(K409K, 1227G>A) 변이가 음성인 검체는 BAGene SSP(BAG Health Care GmbH, Germany)와 BioArray molecular Beadchip assay(BioArray Solutions Ltd., USA)를 사용하여 부분-D형과 약-D형으로 구별하였으며, 이 방법으로 구별되지 않는 검체는 대한적십자사 혈액수혈연구원에서 RHD 유전자의 전체 exon 염기서열분석을 진행하였다.
RHD 유전자 검사결과 110명 중 89명(80.9%)이 순수 RhD 음성으로 확인되었으며 나머지 21명(19.1%)은 RhD 변이형으로 확인되었다. RhD 변이형 중 아시아인에게서 유독 많은 ‘Asia type DEL형’을 보유한 사람이 14명(66.6%, 14/21)으로 절반이 넘었다. RhCE 표현형 빈도를 살펴보면 ccee형 58명, Ccee형 21명, ccEe형 19명, CcEe형 6명, ccEE형와 CCee형은 각 3명이었다. 그 중 ccee형은 DEL형 등 변이형에서는 나타나지 않았다(Table 2). 이러한 결과는 ccee를 가진 52.7%(58/110)는 RHD 유전자 검사를 하지 않고도 순수 RhD 음성으로 진단할 수 있음을 암시하였다.

RhD 음성 및 DEL형 수혈방안에 대한 전문가 설문조사

RhD 음성 및 DEL형 수혈방안에 대한 전반적인 전문가 의견 수집을 위해 설문형식의 자문을 실시하였으며 E-mail을 이용하여 설문조사를 진행하였다.
공급혈액원 및 의료기관혈액원 전문가와 응급의학, 산부인과 등 임상의 대상으로 RhD 음성 및 DEL형 수혈방안에 관한 설문을 실시하였으며 총 45명이 응답하였다. 응급상황에서 RhD 음성 혈액이 부족할 경우 적혈구제제 수혈방침에 대한 질문에는 응답자의 62.2%가 국가수혈가이드라인에 따라 RhD 양성 적혈구제제를 RhD 음성 환자에게 수혈한다고 답하였으며, 일부(31.1%)는 가임기 여성의 경우를 제외하고 RhD 양성 적혈구제제를 수혈한다고 답하였다. Asia type DEL형 환자의 수혈정책에 대한 질문에는 대부분(88.9%)이 RhD 음성 혈액이 부족한 응급상황에서만 RhD 양성 혈액제제를 수혈해야 한다고 답하였고 일부(11.1%)는 기본적으로 RhD 양성 혈액제제를 수혈해도 된다고 답하였다. Asia type DEL형 임산부의 임신 후기나 출산 직후 Rh 면역글로불린 투여에 대해서는 대부분의 전문가(77.8%)가 Asia type DEL형이 확인된 임산부에게도 RhD 음성 임산부와 동일하게 Rh 면역글로불린을 투여해야한다고 답하였고 일부(17.8%)는 투여하지 않아도 된다고 답하였다(Table 3).


맺는말

항-D를 보유한 RhD 음성 환자가 RhD 양성 혈액을 수혈 받게 된다면 급성 및 지연성용혈성수혈반응이 발생할 가능성이 높아진다. 또한 가임기 여성의 경우에는 RhD 양성 아이의 임신 시 태아신생아용혈성질환으로 태아가 사망에 이를 수 있다. 따라서 RhD 음성자에게 항-D가 생성되지 않도록 예방하는 것은 매우 중요하다.
국내 보고 사례 고찰을 통해 기존 혈청학적 검사법으로 RhD 음성으로 분류되어온 DEL형 혈액제제가 RhD 음성자에게 수혈되면 항-D를 유발함을 확인할 수 있었다. 이러한 사례의 발생을 막기 위해 그간 대한적십자사에서는 등록된 RhD 음성 헌혈자에 대해 순수 RhD 음성과 DEL형을 구분하기 위한 사업을 진행하였고 2017년도부터는 신규 RhD 음성 헌혈자에 대해 DEL형 구분 검사를 시행하고 있다.
의료기관에서는 RhD 음성 혈액제제의 재고가 줄어들 상황을 고려하여, 환자를 순수 RhD 음성과 DEL형을 포함한 RhD 변이형으로 감별할 수 있는 진단 체계를 구축하여야 한다. Rh 아형 중 ccee형은 RhD 변이형에는 존재하지 않는 것으로 확인된 보고[5,6]와 본 연구의 조사결과를 근거로 Rh 아형(C/c/E/e) 표현형검사를 활용하면 50% 이상의 환자에게 RHD 유전자 검사를 생략할 수 있으므로 비용을 절감할 수 있을 것이다(Figure 1). DEL형을 정확히 구분하기 위해서는 RHD 유전자 검사가 권장되며 이는 2016년 신의료기술로 승인되었으므로(보건복지부고시 제2016-68호, ’16.5.3.) 의료기관에서 사용할 수 있다. 또한 희귀혈액등록체계 가입의료기관의 경우 무료로 검사의뢰가 가능하다. 의료기관에서 DEL형 환자를 감별한다면 RhD 음성 혈액의 수급이 어려울 경우 DEL형 환자에게는 RhD 양성 혈액을 우선 수혈하는 등의 선별적인 수혈 방안을 수립하는 데 도움이 될 것이다. 국내 DEL형 중 대부분인 Asia type DEL형은 RhD 양성 혈액제제를 수혈 받아도 비교적 안전한 것으로 보고되었고[9], 2016년 개정 발간된 제4판 수혈가이드라인(2016 전면개정)에 이러한 내용이 인용되었다[10]. 그러나 고위험군에 속하는 가임기 여성이나 임산부, 항-D를 가지고 있는 환자의 경우 RhD 양성 혈액제제의 수혈은 위험이 있을 수 있으므로 고위험군은 위험도를 고려하여 RhD 음성 혈액을 우선 수혈하는 전략이 보다 안전할 것이다(Figure 2).
질병관리본부에서는 RhD 음성자 봉사회, 의료계, 공급혈액원 등을 대상으로 학회발표, 수혈가이드라인, 언론, 논문 등을 통해 DEL형에 대해 홍보하였으며, 헌혈자 전수조사 및 신의료기술 승인에 이바지하였다. 앞으로도 DEL형에 대한 헌혈자 및 수혈자에 대한 정책을 수립하여, 안전수혈이 이루어지도록 노력할 것이다.


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8. Yoon J, Koh YE, Kim HN, Kim J, Jung BK, Lee SA, Oh DJ, Lim CS. 2016. A Case of Primary Anti-D Alloimmunization by RHD (c.1227G>A) DEL Red Blood Cell Transfusion. Korean J Blood Transfus. 27(2):169-73.
9. Shao CP. 2010. Transfusion of RhD-positive blood in "Asia type" DEL recipients. N Engl J Med. 362:472-3.
10. 질병관리본부. 2016. 제4판 수혈가이드라인(2016 전면개정). 15-6.
11. Seo MH, Won EJ, Hong YJ, Chun S, Kwon JR, Choi YS, Kim JN, Lee SA, Lim AH, Kim SH, Park KU, Cho D. 2016. An effective diagnostic strategy for accurate detection of RhD variants including Asian DEL type in apparently RhD-negative blood donors in Korea. Vox Sang. 111(4):425-430.
12. 질병관리본부. 2015. 국내 RhD 음성자 안전성 확보방안.
13. 질병관리본부. 2016. 국내 RhD 음성자 수혈 안전성 확보방안(2차년도).
14. 질병관리본부. 2017. 국내 RhD 음성자 수혈 안전성 확보방안(3차년도).