Abstract

Identification of clinical isolates of Aspergillus species from Korean hospitals by using MALDI TOF-MS and molecular sequencing methods

Kim Il-Hwan, Park Chan*
Division of Antimicrobial Resistance, Center for Infectious Disease Research, KNIH, KCDC
Shin JongHee
Department of Laboratory Medicine, Chonnam National University Medical School, Republic of Korea

Background: Aspergillus species are a leading cause of invasive fungal infections, especially in immunocompromised patients, but their correct identification is challenging. We evaluated matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of clinical isolates of Aspergillus species, in comparison with sequence-based identification.
Methodology: Clinical isolates of Aspergillus species from 11 hospitals in Korea were identified by gene sequencing of the D1/D2 domain, internal transcribed spacer (ITS), and β-tubulin regions. The identification results between MALDI Biotyper and sequence-based identification were compared.
Results: Sequencing identification of the D1/D2 domain or ITS classified all Aspergillus isolates into six Aspergillus species complexes, and the β-tubulin sequencing method identified several cryptic species. The rates of correct identification of the MALDI Biotyper were 98.6% at the complex level and 88.2% at the species level. Misidentification at the complex level was observed in only 1.4% of cases. Among clinical isolates belonging to 5 cryptic species, only Aspergillus tamarii isolates were identified correctly from the MALDI Biotyper.
Conclusion: The MALDI-TOF MS is highly reliable for identifying clinical isolates of Aspergillus species at the complex level in clinical microbiology laboratories.



  들어가는 말

최근 면역이 약화되거나 중증질환을 가진 환자의 수가 증가됨에 따라 아스페르길루스에 의한 기회감염 진균증이 크게 증가하였다[1]. 아스페르길루스는 공기, 곡식, 건초, 흙 및 식물 등 환경에 매우 흔하게 존재하는 균사형 진균으로써 전 세계 어디에서나 발견되는데, 칸디다와는 달리 인체의 정상 균총이 아닌 외인성으로, 호흡기를 통해 흡입되어 주로 폐 감염증을 유발한다. 아스페르길루스에 의한 인체감염의 유형은 숙주의 국소 또는 전신의 상태에 좌우되는데, 비강, 부비동 및 하부 기관지에 나타나는 알레르기 반응, 폐쇄된 부비동, 기관지 또는 폐 동공 내의 이차적 집락형성, 경미한 면역저하 환자에게서 발생하는 기관지나 폐 실질의 침습 감염, 그리고 심한 면역결핍 환자에서 나타나는 침습성 폐감염 및 파종성 전신감염 등 다양하다. 아스페르길루스는 특히 혈액 종양이나 스테로이드 치료 등 면역저하 환자에서 치명적인 침습성 진균 감염의 주요 원인이 되고 있다[1].
현재 약 40종의 아스페르길루스 균종이 사람과 동물에서 병을 일으킨다고 알려져 있다. 감염의 원인균으로는 Aspergillus fumigatus가 가장 흔하지만, Aspergillus flavus, Aspergillus niger 및 Aspergillus terreus 등도 중요 병원균이 되고 있고 최근에는 드문 균종에 의한 침습성 감염이 보고되고 있다[1]. 따라서 감염 병소에서 배양 분리된 아스페르길루스를 정확하게 동정하는 것은 진균증 진단과 항진균제 치료방향을 정하는데 매우 중요하다[3, 4]. 아스페르길루스의 동정을 위해 사용되는 전통적 방법은 주로 집락과 현미경 관찰 등 형태학적 방법인데, 이 방법은 흔한 아스페르길루스 균종만을 동정할 수 있고, 드문 균종의 경우 종종 다른 균종으로 잘못 동정된다[3, 4]. 또한 이러한 형태학적 동정법은 숙련된 전문가가 아니면, 동정하기 어려운 문제점이 있다. 이에 따라 최근에는 유전자 염기서열분석과 말디토프 질량분석기(Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)를 이용하여 임상 검체에서 분리된 아스페르길루스 균종의 동정을 시도하고 있다[5-10].
유전자 염기서열분석과 말디토프 질량분석기 분석법은 임상 검체에서 분리된 세균, 효모균 뿐만 아니라 균사형 진균의 정확한 동정을 위한 새로운 방법으로 소개되고 있다[6-10]. 유전자 염기서열분석법을 이용한 진균의 동정법은 정확하지만 비용과 시간이 많이 소요되어 검사실에서 일반적으로 사용하기는 어려운 반면, 질량분석기를 이용한 방법은 빠르며 사용하기 쉽고 비용 효율적이기에 검사실에서 사용하기 편리하다. 현재 몇몇 연구에서 말디토프 질량분석기로 아스페르길루스 균종 동정을 실시하여 보고하였지만 기기에서 자체 제공되는 데이터베이스가 충분하지 못해 대부분 각 검사실에서 직접 제작한(in-house) 데이터베이스를 사용하여 동정을 해야 했다[5, 6]. 그러나 직접 제작한 데이터베이스는 여러 종의 표준 진균 균종을 보유한 표준검사실에서만 제작이 가능하며 검사실마다 사용하는 배양조건, 검체 전처리 과정 및 추출과정이 다르므로 이를 다른 검사실에서 사용하는 것은 용이하지 않다. 최근 균사형 진균을 동정하기 위한 최초의 상용 데이터베이스인 MALDI Biotyper의 Filamentous Fungi Library version 1.0 (Bruker Daltonik, Bremen, Germany)가 출시되었다. 현재까지 3건의 연구에서 아스페르길루스 종의 임상 분리주 동정을 위해 Bruker Filamentous Fungi Library version 1.0을 평가하였으나 이들 연구는 모두 10주 미만의 소수 균주를 대상으로 하였다[6-8]. 본 연구에서는 국내 다기관에서 분리된 아스페르길루스 분리주를 대상으로 말디토프 질량분석기 분석법으로 동정을 실시하고, 최초로 internal transcribed spacer(ITS), 26S rRNA의 D1/D2 domains, β-tubulin 및 calmodulin 부위 염기서열분석을 이용한 동정 결과와 비교해 보았기에 그 결과를 소개하고자 한다[10, 11].



  몸 말


1) 유전자 염기서열분석에 의한 아스페르길루스 균종 동정
일반적으로 유전자 염기서열분석법을 이용하여 효모균과 균사형 진균을 동정하기 위해서는 주로 리보솜 유전자 부위를 분석한다. 본 연구에서는 2012년과 2013년 국내 11개 병원에서 분리된 총 351주의 아스페르길루스를 대상으로 유전자 염기서열분석을 실시하였다. 4가지 유전자 부위, 즉 ITS, 26S rRNA의 D1/D2 domains, β-tubulin 및 calmodulin 부위에 대한 primer(Table 1)를 이용한 염기서열분석을 통해 균종 동정을 실시하였다.
전체 351주는 ITS, D1/D2 유전자 염기서열분석에 의해 7가지 종 복합체(species complex)로 동정되는데, β-tubulin 염기서열분석을 이용하면 임상검체에서 분리된 아스페르길루스 분리주가 균종 수준까지 대부분 잘 동정되고 숨은 균종(cryptic species) 역시 다수 동정됨을 알 수 있었다(Table 2).
ITS, D1/D2 유전자 염기서열분석에 의해 동정된 7가지 아스페르길루스 종 복합체 중 A. fumigatus 종 복합체가 148주(42.2%)로 가장 많았고 A. niger 종 복합체가 82주(23.4%), A. flavus 종 복합체가 55주(15.7%) 순이었고, amphotericin B에 자연내성을 보인다고 알려진 A. terreus 종 복합체가 전체의 44주(12.5%) 이었다. 항진균제 내성을 보일 수 있는 균종인 A. nidulans 종 복합체와 A. ustus 종 복합체도 각각 2주 및 1주씩 관찰되었다.
최근 유전자 염기서열분석법에 의한 진균의 계통 발생학적 분류가 발달함에 따라 한 가지 종 복합체 내에 여러 다른 균종이 포함되어 있음이 발견되었는데 이를 숨은 균종(cryptic species)이라 한다[2, 3, 10]. Table 2를 살펴보면, β-tubulin이나 calmodulin 분석에 의해서 A. fumigatus 종 복합체 내에 Aspergillus lentulus 균종이, A. niger 종 복합체 내에 Aspergillus tubingensis 균종이, A. versicolor 종 복합체 내에 Aspergillus sydowii 등이 숨어있는 균종으로 동정됨을 알 수 있다. 이러한 숨은 아스페르길루스 균종은 항진균제 감수성 양상이 매우 다르거나 병인성이 달라 임상적 의의가 있을 수 있으나 전통적 동정법으로는 동정이 어렵거나 불가능하다. 본 연구 결과 국내 분리주 중 β-tubulin이나 calmodulin 분석에 의해서만 동정된 숨은 균종은 총 44주(12.5%)로, A. tubingenesis 22주, A. sydowii 16주, A. tamarii 2주, A. lentulus 2주, A. creber 1주 및 A. calidoustus 1주 이었다. 비록 이러한 숨은 균종들은 적지만, 항진균제 치료가 필요한 경우에는 β-tubulin 유전자 염기서열분석을 이용한 정확한 동정이 필요하다고 생각된다.
Table 3은 β-tubulin이나 calmodulin 염기서열분석 등으로 최종 동정된 결과를 각 검체별로 분석한 결과이다. 전체 분리주 중 221주(63.0%)가 호흡기에서 분리되었고, 귀 81주(23.1%), 창상 및 농 29주(8.3%) 순이었다. 호흡기에서 분리된 분리주는 A. fumigatus 122주(55.2%), A. niger와 A. flavus가 각각 25주(11.3%) 및 A. terreus 20주(9.0%) 순이었고, 귀에서 분리된 분리주는 A. niger 30주(37.0%), A. terreus 22주(27.2%) 및 A. flavus 14주(17.3%) 순이었다.

2) 말디토프 질량분석기를 이용한 아스페르길루스 균종 동정
11개의 국내 병원에서 수집된 346주의 아스페르길루스를 이용하여 MALDI Biotyper의 Bruker library가 아스페르길루스 종을 동정하는 능력과 염기서열 기반 동정을 비교하여 평가하였다[10]. Bruker MALDI Biotyper에 의한 동정은 액체배양을 실시한 후 ethanol-formic acid 추출법으로 시행하였다. 아스페르길루스 종의 임상 분리주 동정을 위해 MALDI Biotyper의 Bruker Filamentous Fungi Library version 1.0을 이용한 동정 성적과 ITS 및 β-tubulin 등의 유전자 염기서열분석 결과를 비교하였다. ITS 영역 염기서열분석의 결과와 비교하여 cut-off 값 1.7을 기준으로 하였을 때, 종 복합체 수준의 정확한 동정 빈도는 98.6% 이었다. β-tubulin 염기서열분석의 결과와 비교할 때, 숨은 균종이 아닌 흔한 A. fumigatus, A. flavus, A. niger, A. terreus 및 A. versicolor의 5가지 종 복합체에 대하여 종 수준에서의 정확한 동정 빈도는 100%였으나, β-tubulin 또는 calmodulin 염기서열분석으로 확인한 숨은 균종 42주의 아스페르길루스에 대하여서는 2주의 A. tamarii 만을 제대로 동정하여, 종 수준에서의 정확한 동정 빈도는 4.8% (2/42)에 그쳤다. 이 결과는 Filamentous Fungi Library version 1.0을 사용하는 MALDI Biotyper가 대부분의 흔한 아스페르길루스 임상 분리주의 경우 종 복합체 수준으로 비교적 정확하게 동정하지만 임상적으로 드문 숨은 균종의 동정을 위해서는 그 데이터베이스를 확장해야한다는 것을 보여주었다. 질량분석기 MALDI Biotyper(Cut-off value 1.7 기준으로)는 전체 분리주의 98.6%를 종 복합체 수준까지 정확하게 동정하였으나 균종 수준까지 동정할 경우는 88.2% 이었다. 따라서 말디토프 질량분석기를 사용하는 경우, A. terreus, A. nidulans 및 A. ustus와 같은 균종을 동정할 수 있으리라 생각되지만, 숨은 균종 중 A. lentulus와 같은 균종의 동정에는 β-tubulin 염기서열분석이 필요하다고 생각된다.


  맺는 말


본 연구에서는 최근 국내에 도입되기 시작한 말디토프 질량분석기를 이용하여 국내 병원분리 아스페르길루스 분리주의 동정을 실시하고 이를 β-tubulin 염기서열분석에 의한 균종 동정 및 ITS 혹은 D1/D2 염기서열분석 결과에 의한 종 복합체 동정 성적과 비교 분석하여 보았다. 그 결과, ITS 부위와 26S rRNA의 D1/D2 domains 부위에 대해 염기서열분석을 시행하면 아스페르길루스의 경우 종 복합체 수준의 동정은 가능하나 균종의 동정에는 부적합함을 알 수 있었다. 반면 β-tubulin 염기서열분석법으로는 임상검체에서 분리된 대부분 아스페루길루스 분리주의 균종 동정 및 숨은 균종의 동정까지 가능하였다. 말디토프 질량분석기를 이용할 경우 숨은 균종의 동정은 어렵지만, A. fumigatus, A. flavus, A. niger, A. terreus 및 A. versicolor 등의 종 복합체 수준까지는 잘 동정할 수 있었다. 따라서 임상검체에서 분리된 균사형 진균을 질량분석기를 이용하여 동정을 한다면 A. terreus, A. ustus, A. nidulans 와 같은 amphotericin B 자연 내성 주요 균종을 검출하는데 큰 도움이 될 것으로 생각된다. 특히 이는 유전자 염기서열분석법에 비해 간단ㆍ신속하고, 그 비용이 상대적으로 저렴하여 일반 검사실에서 널리 이용될 수 있으리라 생각된다.


이 글은 전남대학교 의과대학 진단검사의학과(신종희 교수)에서 질병관리본부 정책연구용역사업 “아스페르길루스균의 동정법 확립 및 항진균제 내성 획득 기전 조사”를 수행한 결과 출판된 <Diag Microbiol Infect Dis. 2017;87:28-31 [11]> 내용을 포함하여 작성한 글입니다.


  참고문헌

1. Alastruey-Izquierdo A, Mellado E, Cuenca-Estrella M. Current section and species complex concepts in Aspergillus: recommendations for routine daily practice. Ann N Y Acad Sci. 2012;1273:18-24.
2. Al-Wathiqi F, Ahmad S, Khan Z. Molecular identification and antifungal susceptibility profile of Aspergillus flavus isolates recovered from clinical specimens in Kuwait. BMC Infect Dis. 2013;13:126
3. Balajee SA, Nickle D, Varga J, et al. Molecular studies reveal frequent misidentification of Aspergillus fumigatus by morphotyping. Eukaryot Cell. 2006;5(10):1705-12.
4. Balajee SA, Houbraken J, Verweij PE, et al. Aspergillus species identification in the clinical setting. Stud Mycol. 2007;59:39-46.
5. Lau AF, Drake SK, Calhoun LB, et al. Development of a clinically comprehensive database and a simple procedure for identification of molds from solid media by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 2013;51:828-34.
6. Ranque S, Normand AC, Cassagne C, et al. MALDI-TOF mass spectrometry identification of filamentous fungi in the clinical laboratory. Mycoses. 2014;57:135-40.
7. Riat A, Hinrikson H, Barras V, et al. Confident identification of filamentous fungi by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry without subculture-based sample preparation. Int J Infect Dis. 2015;35:43-5.
8. Schulthess B, Ledermann R, Mouttet F, et al. Use of the Bruker MALDI Biotyper for identification of molds in the clinical mycology laboratory. J Clin Microbiol. 2014;52:2797-803.
9. Sleiman S, Halliday CL, Chapman B, et al. Performance of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for the identification of Aspergillus, Scedosporium, and Fusarium spp. in the Australian clinical setting. J Clin Microbiol. 2016;54:2182-86.
10. Heo MS, Shin JH, Choi MJ, et al. Molecular identification and amphotericin B susceptibility testing of clinical isolates of Aspergillus from 11 hospitals in Korea. Ann Lab Med. 2015;35(6):602-10.
11. Park JU, Shin JH, Choi MJ, et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-fight mass spectrometry for identification of 345 clinical isolates of Aspergillus species from 11 korean hospitals: comparison with molecular identification. Diag Microbiol Infect Dis. 2017;87(1):28-31.