Abstract

Whole genome sequencing of type A influenza virus by next-generation sequencing

Kim Heui Man, Lee Namjoo, Kim Mi-Seon, Chung Yoon-Seok, Kang Chun
Division of Viral Diseases, Center for Laboratory Control of Infectious Diseases, KCDC

Background: Since influenza viruses are mutated frequently, the sequencing of their hemagglutinin (HA) antigen helps researchers to compare newly discovered clinical isolates with existing vaccine strains to characterize their receptor affinity and pathogenicity. Similarly, sequencing of the neuraminidase (NA) antigen is important for estimating anti-influenza drug resistance.
Present condition: Traditional genetic sequencing techniques, such as the Sanger method, have has several limitations. First, sequencing of a single gene segment of a virus sample involves several laboratory steps that can cause contamination. Second, several polymerase chain reactions (PCRs) need to be performed successively due to the long length of some genes, such as the polymerase genes. Finally, in case of influenza A, frequent mutations make it necessary to redesign the primer sequences because of mismatches with the template sequence. Therefore, next-generation sequencing is employed to prevent contamination of samples and to allow whole genome sequencing regardless of mutations.
Future Perspective: In this study, we performed whole-genome sequencing of influenza isolates obtained from respiratory specimens of Korean subjects and vaccine strain by multi-segment reverse tranion - PCR and NGS analyses. The continual use of NGS could produce a large amount of information for analysis of genetic characteristics of influenza strains as well as an estimation of the performance of commercial vaccine stocks. It could also be used to construct an effective diagnostic system and assess disease risks to humans by analysis of the mutations of recently evolved influenza A strains.

Keywords: Whole genome sequencing, Influenza A virus, Next generation sequencing, Pathogenicity, Mutation


들어가는 말

인플루엔자 바이러스는 A, B, C, D형으로 나뉘며 그 중 A형과 B형은 인체감염 시 임상증상을 일으키므로 3가 및 4가 백신의 주요 항원으로 사용된다[1]. A형 인플루엔자 바이러스에는 계절인플루엔자 A/H1N1과 A/H3N2 뿐만 아니라 모든 조류인플루엔자가 속하며 변이가 빈번하게 발생되어 여러 번의 대유행(Pandemic)을 일으킨 바이러스이다. A형 인플루엔자는 8개의 (-)RNA 분절로 이루어져 있으며 그 중 HA와 NA 유전자는 표면 당단백질(Glycoprotein)을 구성하는 주요 항원이다. 현재까지 HA는 1∼18, NA는 1∼11의 아형이 보고되었으며[2] HA 단백질은 바이러스가 숙주세포에 부착하는 부위로 바이러스의 특성을 결정하는 주요 항원 부위이다[3]. NA는 숙주세포 내에 감염된 인플루엔자 바이러스가 밖으로 나올 수 있도록 HA 단백질을 끊어주는 가위의 역할을 하며[4] 인플루엔자 치료제로 사용되는 Oseltamivir, Zanamivir 및 Peramivir 등은 이 NA의 가위 기능을 억제시켜 체내에서 바이러스의 증식을 막는다. 그러나 NA 염기서열 중 H275Y 등의 변이를 갖는 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 치료제에 내성[5]을 보이므로 NA 염기서열 분석은 내성주를 감별하는데 필수적이다. HA와 NA 염기서열뿐만 아니라 전장 유전자 분석을 통하여 인플루엔자의 병원성(Pathogenesis), 전파능력(Transmissibility), 적응성(Adaptation)과 숙주 면역원성 저하와 관련된 변이를 확인함으로써 신종인플루엔자 발생 시 신속한 위해도 평가(Risk assessment)를 할 수 있다. 기존의 Sanger sequencing 방법을 통한 인플루엔자 유전자 분석은 역전사(Reverse tranion)로 cDNA를 합성하고 8개의 RNA 분절에 대한 각각의 특이 프라이머로 PCR을 수행해야 한다. 또한 DNA 산물을 정제한 후 sequencing을 위한 PCR 반응을 다시 수행해야 한다[6]. 따라서 Polymerase(PB2, PB1, PA)와 같이 상대적으로 길이가 긴 유전자의 경우 분절로 나누어서 PCR을 해야 하는 번거로움이 있다. 더욱이 A형 인플루엔자는 변이가 빈번하기 때문에 프라이머에 mismatch가 있는 경우 이를 다시 디자인해야 하는 번거로움도 있다.
이 글에서는 차세대 염기서열분석법(Next generation sequencing, NGS)을 이용하여 2009년 인플루엔자 대유행의 원인 바이러스인 국내 분리주 A/Korea/01/2009(H1N1)와 2015-2016절기 A형 인플루엔자 H3N2 북반구 백신주인 A/Switzerland/9715293/2013에 대한 전장 유전자를 생산하기 위한 최적의 NGS 실험방법을 확립하였다. 뿐만 아니라 호흡기 검체에서 직접 NGS법을 적용하여 전장 유전자를 확인하고 각 유전자 분절의 변이에 대한 의미를 해석하였으며, NA 유전자의 Quasispecies sequencing을 통하여 H275Y 변이에 의한 인플루엔자 치료제 내성을 분석하였다.


몸 말


기존 Sanger sequencing 방법 보다 신속하게 인플루엔자 바이러스의 전장 유전자 정보를 생산하기 위하여 Multi-segment RT-PCR법[7]과 NGS 방법을 활용하였다. Sanger sequencing 방법에서는 E. Hoffman 등이 제시하였던 RNA 3’ 말단에 상보적인 프라이머(U12)를 이용하여 역전사효소(Reverse tranase)로 cDNA를 합성하고, 각 유전자 분절에 특이적 프라이머를 이용하는 RT-PCR 방법으로 각각의 8개 유전자를 합성하였다(Figure 1A). 반면 Bin Zhou 등[7]에 의해 제시된 Multi-segment RT-PCR법은 인플루엔자 바이러스 RNA의 3’ 및 5’ 말단부의 프로모터 부위에 보존적인 염기서열을 이용하여 단 한번의 RT-PCR과정으로 8개 분절에 대한 유전자의 증폭이 가능하며 유전자 산물을 이용하여 Reverse genetics에도 활용이 가능하도록 고안하였다(Figure 1B).
이 연구에서는 Bin Zhou 등[7]이 보고한 universal 프라이머(U12, U13)를 이용하였으며, Multi-segment RT-PCR법을 통해 바이러스 국내 분리주인 A/Korea/01/2009(H1N1)와 2015-2016 절기 백신주인 A/Switzerland/9715293/2013 H3N2를 사용하여 전장 유전자 생산 방법을 확립하였다(Table 1,2).
이 연구에서는 Bin Zhou 등[7]이 보고한 universal 프라이머(U12, U13)를 이용하였으며, Multi-segment RT-PCR법을 통해 바이러스 국내 분리주인 A/Korea/01/2009(H1N1)와 2015-2016 절기 백신주인 A/Switzerland/9715293/2013 H3N2를 사용하여 전장 유전자 생산 방법을 확립하였다(Table 1,2).
Multi-segment RT-PCR법을 통해 생산된 유전자 산물은 Miseq(Illumina Inc.) 장비로 library preparation, cluster generation, sequencing 및 data analysis 단계를 거쳐 A형 인플루엔자에 대한 전장 유전자 정보를 생산하였다(Figure 3).
전장 유전자 분석을 위한 바이러스의 최소 농도를 확인하기 위하여 국내 분리주(A/Korea/01/2009)에서 RNA를 추출한 후 2진 및 10진으로 희석하여 단계별로 Multi-segment RT-PCR법을 수행한 결과 10 pg/㎕의 RNA 농도까지 NGS 분석이 가능한 농도를 확인하였다(Figure 4).
Real-time RT-PCR을 이용한 A형 인플루엔자 진단법에서 NGS 분석이 가능한 최소 Ct(Threshold cycle) 값을 확인하기 위하여 국내 분리주(A/Korea/01/2009)에서 RNA를 추출한 후 10진 희석하여 농도 별로 Real-time RT-PCR을 수행한 결과 대략 32 Ct 값에서 10 pg/㎕의 RNA 농도가 확인되었으므로 32 이하의 Ct 값을 갖는 호흡기 검체에서도 NGS를 이용한 분석이 가능할 것으로 판단되었다(Figure 5).
2017-2018절기 A/H1N1과 A/H3N2로 진단된 호흡기 검체 중 Ct 값 32 이하 검체로부터 NGS법으로 200만～300만 리드가 생산되었으며 전장 유전자를 확보하였다. 2017-2018절기 백신주 대비 변이 분석을 수행한 결과 유전자 별로 변이가 확인되었다(Table 4).
2017-2018절기 A/H1N1과 A/H3N2로 진단된 호흡기 검체 중 Ct 값 32 이하 검체로부터 NGS법으로 200만~300만 리드가 생산되었으며 전장 유전자를 확보하였다. 2017-2018절기 백신주 대비 변이 분석을 수행한 결과 유전자 별로 변이가 확인되었다(Table 4).
각 유전자 분절의 변이는 FluSurver(http://flusurver.bii.a-star.edu.sg/)를 이용하여 현재까지 밝혀진 변이에 의한 기능적 분석을 수행할 수 있다(Table 5, 6). 또한 NA의 유전자에 대하여 Quasispecies sequence 분석을 수행한 결과, H1N1과 H3N2의 호흡기 검체에서 생산된 NA 유전자에는 치료제 내성에 관여하는 H275Y 변이가 확인되지 않았다.


맺는 말


이 연구를 통하여 A형 인플루엔자 바이러스 유전자 말단에 universal 프라이머(U12, U13)를 이용한 Multi-segment RT-PCR법으로 단일 PCR 반응에서 인플루엔자 바이러스의 8개 분절에 대한 전장 유전자 정보를 확보하였다. 뿐만 아니라 국내 분리주와 백신주에 대한 전장 염기서열을 생산함으로써, 차세대 염기서열 분석법을 활용할 경우, 기존의 Sanger sequencing 방식보다 간단하고 신속하게 전장 유전자 분석이 가능함을 확인하였다. 따라서 차세대 염기서열 분석법을 지속적으로 활용한다면 국내 인플루엔자 분리주의 유전적 특성을 분석하고 백신주와의 상동성을 분석할 수 있는 대량의 유전자 정보를 생산할 수 있을 것이다. 또한 신종인플루엔자 발생 시 유전적 특성을 신속하게 분석함으로써 효율적인 진단체계 구축 및 변이 분석을 통한 인체 위해도 평가에 활용할 수 있을 것이다.

이 원고는 질병관리본부 연구과제 (2014-NI43001-00)와 질병조사관리 및 실험실감시망운영 (4851-304) 지원으로 수행된 내용입니다.


참고문헌


1. Influenza (Seasonal) Fact sheet N°211". www.who.int. March 2014. Archived from the original on 30 November 2014. Retrieved 25 November 2014.
2. Tong, Suxiang, et al. New world bats harbor diverse influenza A viruses. PLoS pathogens. 2013;9(10);e1003657.
3. Steinhauer, David A. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology. 1999;258(1):1-20.
4. Nayak, Debi P., Eric Ka-Wai Hui, and Subrata Barman. Assembly and budding of influenza virus. Virus research. 2004:106(2):147-65.
5. Hurt, Aeron C., Hui-Ting Ho, and Ian Barr. Resistance to anti-influenza drugs: adamantanes and neuraminidase inhibitors. Expert review of anti-infective therapy. 2006;4(5):795-805.
6. Hoffmann, E., et al. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. Archives of virology. 2001;146(12):2275-89.
7. Zhou, Bin, et al. Single-reaction genomic amplification accelerates sequencing and vaccine production for classical and Swine origin human influenza a viruses. Journal of virology. 2009;83(19):10309-13.