배아줄기세포 및 역분화줄기세포 등의 전분화능줄기세포는 무한증식과 생체를 이루고 있는 다양한 세포로 분화 할 수 있는 특성을 가지고 있기 때문에 난치병 등의 재생의학에 활용 가능한 세포공급원으로 큰 기대를 모으고 있다. 전분화능줄기세포를 임상에 적용하기 위해서는 수립, 배양 유지, 동결 보존 등 전 단계에서 임상 적용에 적합한 상태로 관리되어야 한다. 현재 몇몇 인간 배아줄기세포를 이용한 줄기세포치료가 국내외에서 임상 승인이 되었으나, 전분화능줄기세포의 수립, 생산, 상업화를 통한 임상용제제 개발은 초기 정립단계에 불과하므로 세포주 수립부터 임상 적용에 이르는 전 과정의 단계별 표준화, 안전한 임상 적용을 위한 지침 및 제도 마련이 요구되고 있다. 임상등급 세포주란 세포치료제 또는 세포치료제의 원재료로써 ‘바이오의약품’과 ‘생물학적제제’로 분류될 수 있어 인체 유래의 제제로 공정과 생산에서 알려지지 않은 잠재적 위험 요소가 발생할 가능성에 대한 대비가 필요하다. 전분화능줄기세포를 임상에 적용하기 위해서는 안전성과 유효성 등의 엄격한 품질관리 하에서 배양이 필수적이다. 최근, 국제적으로 임상등급 전분화능줄기세포 개발을 위한 다양한 연구와 제안들이 보고되고 있으며 이와 관련하여 국제적 표준을 세우고자 하는 움직임이 활발해지고 있다. 역분화줄기세포 수립에는 바이러스나 플라스미드 등 외래성 유전자 등을 이용한 유전자 도입 방식이 적용되기 때문에 임상 적용 이전에 유전적 안전성과 바이러스 오염에 대한 검증은 필수적이지만, 역분화줄기세포는 배아줄기세포와 동일한 자가재생능과 무한증식능의 기초 특성을 가지고 있으며 배양 유지 방법이 유사한 것으로 알려져 있다. 따라서 몸말에서는 인간 배아줄기세포 배양 경험을 바탕으로 한 임상등급 전분화능줄기세포 확보와 관련된 배양 환경 및 제도 등에 대하여 살펴보고자 한다.

Ⅱ. 몸 말


  인간 배아줄기세포는 질환 특이적 세포로 분화 연구 초기에는 신경계 세포 분화에 집중하여 연구가 진행되어 왔다. 그러나 최근에 질환 치료를 위한 다양한 분야의 발전으로 줄기세포 혹은 이종 줄기세포 이식을 이용한 당뇨병, 허혈성 및 간질환 세포치료 연구 등 경제적으로 가치가 높은 치료제 개발이 활성화되고 있다. 2008년 8월 글로벌 다국적 기업 GSK, AstraZeneca, Roche 등은 제약 회사 등은 “Stem Cells for Safer Medicines Ltd”를 설립하고, 인간 배아줄기세포를 이용한 실험 의약품에 대한 안전성 시험방법 개발로 임상시험 진입에 앞서 신규 약물효능, 부작용을 스크리닝하는 효율적인 시스템을 구축하고 있다[1]. 전분화능줄기세포는 분화연구를 통한 발생학적 기전 연구, 환자유래 역분화줄기세포를 이용한 질병 모델의 개발과 신약 개발에서의 활용 등 무한한 가능성을 가지고 있다. 무엇보다도 전분화능줄기세포는 세포치료제로 손상된 생체의 세포와 조직을 대체하여 전통적인 치료를 할 수 없는 난치병의 치료제로 사용될 것에 대한 기대가 가장 크다. 이러한 가능성에도 불구하고 인간 전분화능줄기세포의 임상연구는 아직초기 단계에 머물러 있다. 인간 배아줄기세포유래의 최초 세포치료제로 척추손상치료제인 GRNOPC1가 제론사에 의해 FDA의 승인 하에 진입하였으나 재정적인 문제로 중단 되었다. 미국 ACT사는 2010년부터 인간 배아줄기세포 유래 망막색소상피세포(Retinal pigment epithelial cell, RPE)를 이용한 스타가르트병과 건성 노인성 황반변성증 등의 실명증 치료제로 미국 FDA의 임상 시험을 진행하고 있으며, 최근에는 유럽에서도 동일한 세포를 이용한 임상 시험을 진행하고 있다. 국내의 바이오앤디오스텍은 2011년 5월 식품의약품안전약처로 부터 스타가르트병에 대한 임상시험 승인과 2012년 5월에는 건성 노인성 황반변성증에 대한 승인을 받아 동일한 세포를 이용한 임상 시험을 진행하고 있다[1].

국제적으로 세포치료제 시장은 급성장중에 있고, 300 종 이상의 자가 동종 세포치료제가 개발되고 있으며 이 중 100여 종 이상이 전분화능줄기세포에 해당하는 것으로 보고되었다[2]. 2000년 2월에서 2010년 6월 동안의 글로벌 세포치료제 파이프라인 분석에 따르면 인간 전분화능줄기세포 기반 임상 시험제품을 포함하는 세포치료의 49%는 전임상 또는 임상1상 단계에 해당하는 것으로 알려졌다[2]. 이 시기에 공개된 줄기세포 임상 1750건 중 전분화능줄기세포의 임상은 3건으로 전체 줄기세포 임상시험의 0.2%에 불과하다[2]. 성체줄기세포치료제에 비하여 상대적으로 전분화능줄기세포치료제의 임상시험 진입이 늦은 것은 새로운 형태의 세포치료제에 대한 과학적, 기술적 측면, 안전성, 치료, 정책 및 상업화의 각 요소에 대한 경험 부족으로 다양한 종류의 걸림돌이 존재하기 때문이다. 최근 국내·외의 관련 연구기관과 규제기관에서는 이러한 쟁점들을 해결하기 위해 노력 중에 있다.

전분화능줄기세포 배양 환경
  임상등급 전분화능줄기세포를 확보하기 위해서는 안전하게 인체에 적용할 수 있고 고품질을 보장하는 엄격한 환경에서 대량 생산 및 저장 할 수 있는 기반이 우선적으로 마련되어야 한다. 현재까지 전 세계적으로 1000 여종 이상의 많은 인간 배아줄기세포와 1200 여종의 역분화줄기세포가 수립된 것으로 알려져 있지만, 이들 전분화능줄기세포의 수립, 유지 배양 및 저장과 특정세포로 분화유도 등의 과정이 대부분 실험실 환경에서 이루어지고 있다. Figure 1은 임상등급 인간 배아줄기세포의 확보 방안을 모식화한 것으로 역분화줄기세포도 배아줄기세포와 동일하게 적용 가능할 것이다. 일반적으로 연구용 전분화능줄기세포의 수립, 배양에는 동물 유래 분해 효소와 동물 혈청 등을 사용하고 있다. 특히 인간 전분화능줄기세포는 코로니(Colony) 상태로 자라며 대부분 동물 유래의 피더 세포(Feeder cells)와 함께 배양된다. 생쥐배아섬유아세포(Mouse embryonic fibroblast, MEF)는 피더 세포로 가장 많이 사용하고 있다. 피더 세포의 부착율을 높이기 위한 젤라틴과 세포의 증식을 화학적으로 불활성화 상태로 만들기 위해 Mitomycin C를 이용하게 된다. 이처럼 일반적인 연구등급 전분화능줄기세포의 배양 환경에서 사용되는 많은 종류의 동물 유래 성분과 항생제 등은 잔류 시 임상 적용에 문제를 일으킬 가능성이 있다. 동물 피더 세포를 사용한 전분화능줄기세포의 표면에서 Sialic acid와 Neu5Gc 등의 면역거부인자가 발현되고 있고, 마이코플라스마나 바이러스 등 미생물학 감염성의 위험성이 제기되었다[3]. 이러한 동물성 인자들의 위험성을 배제하기 위하여 배양에 필요한 동물성 인자들을 인간 혈청, 인체 조직 유래 섬유아세포 등의 인체 유래성분을 바꾸는 연구가 활발히 진행 중이다. 나아가 합성 단백질을 이용하여 피더 세포를 대체한 피더-비의존적(Feeder-free) 환경과 동물 성분을 배제한 Xeno-비의존적(Xeno-free) 조건 배양 방법에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 전분화능줄기세포 배양에 보편적으로 사용되고 있는 Extracellular matrix의 일종인 Martigel은 생쥐 Sarcoma 유래물이어서, 피더 세포 MEF의 대체물로 사용하기에는 여전히 잠재적인 위험성이 있다. 이를 개선하기 위하여 Laminin, Vitronectin, E-cadherin 등의 다양한 합성 단백질을 이용하거나, 화학적으로 세포부착율을 보강하는 등 배양 환경을 개선하여 전분화능줄기세포에 적용하고 있다[2, 3]. 그러나 피더-비의존적 환경에서 수립된 배아줄기세포의 계대 배양은 염색체 이상이 보고되어 유전적인 안전성 문제에 대한 충분한 검토가 필요하다. 연구등급 전분화능줄기세포의 동결은 일반적인 동결제로 DMSO를 사용하고 있고, 이 성분 또한 임상적용 시 유해할 수 있다. 임상등급 전분화능줄기세포를 확보하기 위해서는, 함유된 성분이 확실한 한정배지(Defined media)의 사용이 권장된다[2, 3, 4]. 임상등급 전분화능줄기세포 수립, 배양, 저장 등과 관련한 많은 기술적 개발이 시도되고있으나, 현 단계는 방법 및 시료의 표준화와 배양된 세포의 품질에 대한 기준, 검증 및 시험을 위한 평가법이 개발되어야한다.

GMP 등급 전분화능줄기세포
  현재까지 동물성 유래물을 배제한 세포배양액의 이용 및 임상 적용에 보다 적합한 피더 세포 및 합성 단백질을 이용한 피더의 개발 등의 다양한 시도에도 불구하고 이상적인 임상등급 전분화능줄기세포를 확보하기에는 미흡한 점들이 많다. 치료용 의약품은 Good manufacturing practice(GMP) 환경에서 관리되고 있다. GMP는 약학 산업에서 사용되는 표준보증시스템으로 최종 산물(End-product)의 생산과 시험과정을 관리하여 원료물질의 이력 추적에서부터 완제품의 생산과 품질관리 및 출하에 이르기까지 전 분야를 검정된 표준운영지침에 따라 운영하는 엄격한 관리시스템이다. 실험실 수준의 배양과 연구에 머물러있는 전분화능줄기세포를 이용한 섣부른 임상시도의 방지를 위해 GMP 환경에서의 전분화능줄기세포 관리 필요성이 대두되고 있다[3, 5, 6]. 현재 전분화능줄기세포의 임상 적용에 가장 큰 문제점은 임상 시험의 진입에 근거가 되는 가시적 연구 성과가 대부분 실험실 수준에서 세포를 배양하고 비-GMP 등급 시료를 사용하여 특정 세포로 유도 분화하여 확보한 것이기 때문에 임상 적용에 적합한 안전성과 치료제로써의 품질 등을 가늠할 수 없다는 점이다. 따라서 이들 기초연구를 임상에 적합한 세포주로 전환하기 위해서는 우선적으로 GMP 등급의 시료, 초자 및 환경에서 배양되어 저장된 시료 물질(Starting material)이 되는 전분화능줄기세포를 GMP 등급의 마스터 세포은행(Master cell bank)에 확보하여 효율적이고, 안정적으로 공급 가능하여야 한다. 이와 동시에 임상 적용 대상이 되는 조직 또는 특정 세포 및 그 전구체 세포 확보를 위한 우수하고 보장할 만한 실험실 수준의 프로토콜을 선정하여 GMP 생산 공정으로 전환하는 노력이 필요하다. 이들의 과정에서도 주요한 모든 공정에 사용되는 시료 및 초자 등은 GMP 환경에 적합한 것이어야 하며, 생산 공정, 품질, 운영 시스템과 최종산물의 품질 등 실제적인 운영 전반의 과정을 모니터하고 측정 및 기록되어야 할 것이다(Figure 1B). 임상등급 전분화능줄기세포는 최초로 싱가포르 연구자 Crook 등이 6 종의 GMP 등급 인간 배아줄기세포의 수립을 보고하였으나 이들은 완전한 동물성분을 배제하지 못한 상태였다[7]. 이후 인간 유래 세포를 이용한 GMP 등급의 피더 세포의 개발이 보고되었고, 최근 이스라엘 그룹이 GMP 환경 내에서 인간 유래 피더 세포의 개발, 인간 배아줄기세포주의 수립과 배양을 보고하였다[5, 8]. 이들은 임상 등급 세포주에 대한 이스라엘의 규제와 함께 미국 FDA의 규제에 적합한 세포 배양 환경과 동의서 등 전 과정에 필요한 문서 표준운영지침과 함께 다양한 줄기세포의 특성 규명 등의 세포주의 품질 평가법 등도 함께 제안하고 있다. Figure 2는 GMP 등급의 인간 배아줄기세포 확보의 전반적인 과정을 모식화로 나타내고 있다(Figure 2)[5].

세계 각 국은 기 수립된 연구등급 전분화능줄기세포를 임상 등급으로 전환하기 위하여 Xeno-비의존 및 GMP 등급의 전분화능줄기세포를 확보하기 위하여 노력하고 있다. GMP 환경에서 재생산관리(Clean up) 단계를 거친 세포주는 적어도 10계대 이상 배양하면서 알려진 감염원의 오염 여부와 염색체 이상 여부를 심도 있게 관찰하여야 한다[3]. 또한 GMP 환경으로 재생산 관리를 마친 전분화능줄기세포에 대하여 표준화와 품질 평가의 적정한 기준이 마련되어야 할 것이다.


각국의 임상등급 전분화능줄기세포 연구 현황
 ◯영국: UK Stem Cell Bank(UKSCB)는 2004년에 MRC(Medical Research Council)와 BBSRC (Biotechnology and Biological Science Research Council)를 통하여 줄기세포의 정도관리 및 윤리성 확보 관련 연구를 촉진하고 궁극적으로 임상치료제 개발을 대비하기 위한 줄기세포연구 핵심 인프라 구축을 목적으로 설립되었다. 2013년 1월 105개주의 줄기세포주가 등록되어 있으며, 22개의 세포주가 분양 중에 있다. 2011년 말 Ilic 등은 임상 적용의 목적으로 인간 배아줄기세포를 사용하기 위하여 Xeno-비의존 배양 환경에서 정상핵형을 가지는 2개의 인간 배아줄기세포와 Huntington's disease and myotonic dystrophy 1의 돌연변이를 가진 3개의 임상등급 인간 배아줄기세포주를 확보하고, 현재 뱅킹 단계별 특성분석이 진행 중이며 차후 1년 내에 분석 완료와 3년 이내에 임상 적용 등을 목표로 하고 있다[9]. 또한 Stephenson 등은 동결 상태의 배아를 사용하여, Xeno-비의존 배양환경에서 인간 배아줄기세포주를 수립하는 방법과 관련 표준운영지침, 기술적인 방법, GMP 환경에서 임상등급 세포주 관리 방법 등을 개발하였다[10].

 ◯미국: National Institutes of Health(NIH)는 인간 배아줄기세포주의 등록을 담당하고, Wisconsin International Stem Cell Bank(WISC Bank)는 줄기세포주의 검증, 유지 배양, 특성분석 및 분양을 담당하고 있으며, 피더-의존적 인간 배아줄기세포주 21개주, 피더-비의존적 인간 배아줄기세포주 164개주, 피더-비의존 인간 배아줄기세포주 3개주, current GMP(cGMP) 및 cGMP 등급 연구 은행(cGMP matched research bank) 임상등급 인간 배아줄기세포주를 각각 1개주씩 분양하고 있으며 변형 인간 배아줄기세포주 7개주, 역분화줄기세포주 17개주를 각각 분양하고 있다. WiCell 연구소는 Waisman Biomanufacturing의 GMP 시설에서 임상 적용을 위한 GMP 등급 전분화능줄기세포와 GMP 등급 시료 제작 및 품질 검사와 관련된 서비스를 연구자들에 제공하고 있다. cGMP 전분화능줄기세포 생산을 위한 사전 검사 및 준비단계를 WiCell에서 수행하며 Waisman Biomanufacturing에서 cGMP 등급으로 생산하고 품질을 검증하고 있다. GMP 시설에서 피더-비의존적 배양 조건으로 Clean-up 과정을 거친 전분화능줄기세포는 일정 계대 후에 다양한 품질검증 시험을 마친 후 임상 적용 가능 여부를 판단하고 있다(Figure 3)[1].

 ◯싱가포르: 동물성 시료를 배제하여 6개 임상등급 배아줄기세포주[7] 및 Good laboratory practice (GLP) 등급 전임상연구를 위한 배아줄기세포주 4개주 수립을 보고하였다[11].

 ◯이스라엘: Tannenbaum 등은 Xeno-비의존 배양 조건에서 GMP 등급 인간 제대혈 조직 유래 피더 세포를 이용한 인간 배아줄기세포주의 수립을 보고하였다(Figure 2)[5].

 ◯일본: Kyoto 대학팀은 인간 배아줄기세포를 수립한 기관으로 임상 적용을 위한 준비로 GMP 시설을 갖추고 기 수립된 연구등급 인간 배아줄기세포 KhESC 1-5를 임상등급으로 재생산하고 있으며, 동시에 새로운 GMP 등급의 인간배아줄기세포의 수립을 계획하고 있다(Figure 4)[1].

임상등급 전분화능줄기세포의 규제
  유럽 의약국(EMA), 미국 FDA, 국내 식품의약품안전처 등 세계 각 국의 규제기관은 치료제로 사용되는 세포주의 기준으로 GMP 품질의 최적화된 품질과 임상 적용에서의 안전성을 규정하고 있다. 임상등급 전분화능줄기세포의 정의는 기준이 정립되어 있지 않지만, 기존 세포치료제의 품질, 유효성과 안전성 기준에 적합한 세포주를 확보하는 방향으로 정책, 규제, 기술발전 등이 이루어지고 있다. 특히 상대적으로 많은 연구가 진행된 성체줄기세포치료제의 임상 경험은 전분화능줄기세포의 임상 개발 과정에 도움을 줄 것으로 기대된다. 줄기세포치료제는 신체에서 분리된 세포가 사람의 질병치료를 목적으로 세포 단위로 사용될 경우 세포치료제로 규정되어 의약품에 해당하므로 국내에서는 약사법에 의거하여 규제하고 있다. 세포치료제에 대한 국내·외의 규제 기관과 관련 규제 내용은 Table 1과 같다.

임상등급 전분화능줄기세포의 특성 분석과 품질 평가
  연구등급 전분화능줄기세포의 자가재생능과 분화능 등의 기본적인 특성분석은 잘 알려져 있으나, 전분화능줄기세포를 GMP 등급의 시료, 배지 및 환경에서 배양한 경험은 많지 않다. 따라서 GMP 등급 전분화능줄기세포주를 수립한 다음에는 균질의 안정적인 세포주를 공급하기 위한 기준과 미생물 및 바이러스 등의 부정 시험, 염색체 이상 유무 등 줄기세포주 생산 공정 전반의 과정에서 품질 평가를 할 수 있는 기준이 확보되어야 한다. 국내·외에 유관기관에서 실시하고 있는 임상등급 인간 배아줄기세포 품질 관리의 기준 항목은 Table 2와 같다[1].

Ⅲ. 맺는 말


  임상등급 전분화능줄기세포의 확보는 미래 의생명 분야의 발전을 위한 첫걸음이다. 인간 전분화능줄기세포를 실험실 수준에서 임상 적용이 가능 한 형태로 전환하기 위한 당면 과제는 GMP 요구 조건을 충족하는 전분화능줄기세포 배양 프로토콜의 개발과 함께, 전체 제조 공정에대한 재현성, 예측 가능성, 효능 및 비용을 고려하는 것이다. 임상등급 전분화능줄기세포의 생산에는 세포주의 선택(Cell source), 대량생산(Quantity), 최종 산물로써의 세포 순도(Purity), 원하는 Phenotype, 잠재성과 기능(품질)과 함께 저장, 이송과 임상적용 등의 다양한 도전 과제들이 남아 있다(Figure 1C). 또한 이들 공정단계별 검증과 규제 당국의 제도 개선 및 승인 절차, 평가법 등에 관한 법적 기준이 마련되어야 할 것이다. 현 단계에서는 가능한 임상등급 전분화능줄기세포 개발의 전체과정에 따른 걸림돌과 쟁점들을 가능한 시급히 파악하고 현실적으로 가능한 문제부터 하나씩 해결책을 찾아나가야 할 것이다. 또한 배아줄기세포, 역분화줄기세포 및 체세포복제배아(Somatic cell nuclear transfer) 줄기세포 등 다양한 방법에 대한 품질 및 안전에 대한 검증 시스템의 개발도 함께 이루어져야 할 것이다.

Ⅳ. 참고문헌


1. 서울대산학협력단, 2013. 질병관리본부 학술연구용역과제 최종결과보고서; 임상등급 배아줄기세포 구축․운영 방안 마련.
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9. Illic C, Stephenson E, Wood V, Jacquet L, Stevenson D, Petrov A, et al., 2012. Derivation and feeder-free propagation of human embryonic stem cell under xeno-free conditions. Cytotherapy 14: 122-8.
10. Stephenson E, Jacquet L, Miere C, Wood V, Kadeva N, Cornwell G, et al.,, 2012. Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free enviornment. Nat Protoc. 7:1366-81.
11. Sivarajah S, Raj GS, Mathews AJ, Sahib NB, Hwang WS, Crook NM, 2010. The generation of GLP-grade human embryonic stem cell banks from four clinical-grade cell lines for preclinical research. In Vitro Cell Dev Biol Anim 46:210-6.