I. 들어가는 말


  뎅기바이러스(Dengue virus)는 플라비바이러스(Flavivirus) 속의 RNA 바이러스로 4개의 혈청형을 갖고 있으며 열대 및 아열대 기후에 속하는 거의 모든 나라에 분포하고 있다[1]. 이집트숲모기(Aedes aegypti) 및 흰줄숲모기(Aedes albopictus) 종이 주요 매개체이며 바이러스를 보유한 모기가 흡혈하는 과정에서 인체에 침입하여 감염을 일으킨다. 경미한 발열증상에 머무는 질환인 뎅기열(Dengue Fever)은 한 해 1억-2억 명의 환자가 발생하고, 중증 질환인 뎅기출혈열(Dengue Hemorrhagic Fever, DHF)나 뎅기쇽증후군(Dengue Shock Syndrome, DSS)은 연간 약 50만 명의 환자가 보고되며 그 중 2만 명 정도가 사망하는 것으로 추산된다[2].

국내 뎅기열 실험실 진단은 2001년 간접면역형광항체법(Indirect Immunofluorescent Assay, IFA)과 Immunochromatographic kit에 기반한 항체검사로 시작하여 2006년에는 면역효소측정법(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)을 도입하고 역전사중합효소연쇄반응법(Reverse Tranion-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 구축함으로써 혈청학적 검사와 분자진단을 모두 운용하게 되었다[3]. 2012년에는 혈청학적 진단의 기준시험법인 플라크감소중화시험법(Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT)을 구축하였고 이어 2013년에는 세계보건기구 서태평양지역 숙련도평가에 참여하여 뎅기열 실험실 진단능력을 입증하였다[4].

뎅기열 환자 판정 기준은 임상증상이 상기 병증에 일치하고 바이러스 특이적인 IgM(immunoglobulin M) 항체가 검출되었거나, 급성기와 회복기 혈청 간의 항체 역가가 4배 이상 상승한 경우, 또는 바이러스가 검출(분리)되었을 경우이다[5]. 지난 수년간의 자료를 분석해 보면, 연간 뎅기열 의뢰건수 중에서 2차 이상의 회복기 혈청이 접수되는 사례는 평균 2.8%(범위: 0.6-4.5%) 수준에 머물고 있어서 항체역가 상승이나 양전으로 환자를 확진한 사례는 드물다(Table 1). RT-PCR을 이용한 바이러스 유전자 검출은 가장 직접적이고 확정적인 시험법이지만, 이는 시료의 채취시기와 검체의 수송 및 보존 환경에 크게 영향을 받는다. 결과적으로 국내 뎅기열 진단실험실에서의 환자 판정은 해외 여행력 유무와 급성기 혈청에서의 IgM항체 검사가 가장 큰 부분을 차지하고 있다.

국내에서는 실험실 환자감시와 함께 자연계 매개모기에서 뎅기바이러스, 웨스트나일바이러스 등의 감염여부도 조사하고 있으나 아직까지 이들 바이러스가 검출된 적은 없다. 또한 2001년 실험실 진단을 시작한 이래 현재까지 보고된 뎅기열 환자는 모두 해외에서 감염되어 입국한 사례이다. 그러나 뎅기열 유행지역에 여행한 적이 없거나 귀국 후 수개월이 지난 시점에서 유사 증상을 보인 환자 중에서 ELISA 검사결과 IgM 항체 양성을 보인 사례가 있었다. 국내에는 뎅기바이러스를 전파할 수 있는 흰줄숲모기가 존재하고 있기 때문에 해외가 아닌 국내에서의 뎅기열 감염을 배제할 수 없는 상황이었다. 당시에는 확인 진단법인 플라크감소중화시험법을 운용하기 이전이었으므로 환자의 임상적 증상 및 역학조사 등에 근거하여 뎅기열이 아닌 것으로 판정하였다.

진단실험실에서는 상기 사례에 대해 명확한 실험실적 근거를 제시하기 위해 플라크감소중화시험법을 구축하였고 추후 유사 사례에 대응할 수 있도록 기존의 진단 프로세스를 개선하였다. 본 글에서는 상기 환례에 플라크감소중화시험법을 적용한 진단 결과를 기술하고자 한다.

II. 몸말


  실험실 검사 결과만으로 뎅기열 감염여부를 판단하기 어려웠던 사례는 2008-2011년 사이에 총 4건이 있었다(Table 2). 발병 전 뎅기열 발생 국가로 여행한 적이 없음에도 불구하고 ELISA 검사(Dengue IgM capture ELISA, Panbio, Australia)에서 IgM 항체가 검출된 사례가 3건이 있었다. 이 중에서 2건은 발병일 기준 일주일 이내에 채취한 급성기 혈청이었고 나머지 1건은 발병일 정보가 명확하지 않아 병증 진행 단계는 파악하지 못했다. 이들 3건 모두 RT-PCR 수행결과 바이러스 유전자가 검출되지 않아 감염의 직접적인 증거는 없었다. 플라크감소중화시험법이 운용되기 이전이었으므로 항체 검출 결과만으로 판정을 내릴 수 없었고 결국 의료진이 환자의 임상경과에 근거하여 뎅기열이 아닌 것으로 판정하였다. 2011년에는 인도네시아 여행을 다녀온지 2개월이 지난 시점에서 뎅기열 유사 증상을 보인 환자의 혈청에서 ELISA 검사결과 IgM 항체가 검출된 사례가 있었다. 당시 환자는 열, 몸살, 비전형적인 발진 증상을 보였고 혈액검사에서 백혈구감소증과 혈소판감소증, 경미한 간수치 상승이 확인되었다. 최종판정을 위해서는 플라크감소중화시험법을 적용해야 했으나 실험실 여건상 적용할 수가 없었다. 뎅기열 이외의 검사로 일본뇌염, 치쿤구니야열, 웨스트나일열, 황열, 말라리아, 신증후군출혈열, 렙토스피라증 및 쯔쯔가무시증에 대한 검사를 진행했으나 모두 음성이었다. 본 환례는 상기 실험실 검사결과와 임상증상 및 자연계 매개체 감시결과, 다른 원인에 의한 위의 임상증상 발현 가능성 등을 종합하여 뎅기열이 아닌 것으로 판정하였다. ELISA 검사에서 IgM 항체가 검출된 것은 인도네시아 현지에서 불현성 감염이 된 후 생성된 항체가 검출된 것으로 판정하였다.

이후 진단실험실에서는 2012년 하반기에 플라크감소중화시험법을 구축하였고 이를 위의 사례에 적용하였다. 국내에는 뎅기바이러스와 동일한 플라비바이러스속의 일본뇌염바이러스가 존재하고 이들 두 바이러스가 혈청학적 교차반응을 일으키는 점을 고려하여 각기 바이러스에 대해 중화시험법을 진행하였다. 플라크감소중화시험법을 위해서 BHK-21세포를 10% 우태아 혈청이 포함된 MEM배지를 사용하여 6-well 배양플라스크에 4.5x105cells/well이 되도록 분주하고 24-26시간 동안 배양하였다. 검사 혈청은 시험 전 56℃에서 30분간 열처리한 후, 상기 MEM (Minimum Essential Medium)배지를 사용하여 1:5, 1:50, 1:500으로 10배씩 단계 희석하였다. 일본뇌염바이러스 백신주(Nakayama주)와 뎅기바이러스(New Guinea C주, serotype 2) 각각을 상기 MEM 배지에서 100 Plaque Forming Unit(PFU)/0.1mL의 역가로 희석한 후, 미리 희석해둔 혈청 0.1mL과 잘 섞어 37℃에서 1시간 정치하였다. 단층의 BHK-21세포가 배양된 배양플라스크에서 배양액을 제거한 후, 각 well에 상기 0.2mL의 혈청-바이러스 혼합액을 접종하고 37℃ 이산화탄소배양기에서 1시간 동안 정치하였다. 이어서 혈청-바이러스 혼합액을 제거한 후 각 well의 배양세포에 4% 우태아 혈청과 0.9% noble agar(뎅기바이러스는 agarose)가 포함된 MEM배지를 4mL씩 부어 상온에서 굳히고 이산화탄소배양기에서 4-5일 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 배양플라스크의 각 well에 고정액(10% 포르말린이 포함된 인산화완충용액)을 2mL씩을 넣고 30분 동안 고정시켰다. 이어 고정액을 버리고 각 well의 agar 층을 제거한 후, 1% crystal violet용액 1mL씩 넣어 10-30분 동안 배양플라스크 표면에 붙어있는 세포층을 염색하였다. 이어서 염색액을 버리고 각 well을 수돗물로 가볍게 세척한 후 상온에서 건조하였다. 배양플라스크의 각 well의 플라크 수를 계수하여 기준 바이러스 well(100PFU의 역가로 세포를 감염시킴)의 플라크 수를 90% 감소시킨 혈청 희석비(PRNT90%)를 산출하였다. 항체 역가가 1:10 이상인 경우에 양성으로 판정하였고 두 바이러스 간 감별진단은 미국 CDC 방식에 따라 항체 역가 차이 4배를 기준으로 하였다[6].

플라크감소중화시험법을 적용한 결과 상기 4건 모두 뎅기바이러스에 대한 항체역가가 1:10 미만으로 음성결과를 보였다(Table 2). 2011년 환례에서는 급성기와 회복기 혈청 모두에서 음성이었고 양성 기준을 완화하여 PRNT50% 기준을 적용했을 때에도 항체역가가 1:10미만이었다. 이와 함께 타 제조사의 IgM ELISA 시약(InBios, USA)으로 검사한 결과, 4건 모두에서 IgM 음성 결과를 보였다. 중화시험과 타 제조사 시약을 적용해본 결과 상기 4건에서 보인 IgM 항체검출은 ELISA 시약의 비특이적 반응이었던 것으로 결론하였다.

국내 뎅기열 진단실험실에서는 플라크감소중화시험법 구축과 복수의 ELISA시약 운용을 계기로 2013년부터 뎅기열 진단 프로세스를 개선하였다(Figure 1). 검체가 접수되면 해외여행 여부를 파악하고 발병일로부터 채혈일까지의 날짜에 근거하여 어떤 시험법을 적용할 것인지 결정한다. 일차적으로는 IgM ELISA 시약을 사용한 혈청학적 검사와 RT-PCR법에 의한 바이러스 유전자 검출을 수행한다[4]. 시료 채취일이 발병일로부터 10일을 초과한 경우에는 바이러스 핵산이 검출될 가능성이 낮아 RT-PCR법은 적용하지 않는다. RT-PCR 양성을 보인 시료에 대해서는 유전자 증폭산물의 DNA 염기서열분석을 진행하여 혈청형까지 확인하며, RT-PCR에서 음성을 보인 경우에는 ELISA 검사 결과에 따라 판정한다. 해외 여행력이 없는 환자의 시료에서 IgM 항체가 검출된 경우에는 회복기 혈청을 요청하여 플라크감소중화시험법을 적용하여 최종 판정한다. 그러나 대부분의 경우 회복기 혈청 확보가 쉽지 않기 때문에 단수 혈청에서 플라크감소중화시험법을 적용한다. 이와 함께 타 제조사의 ELISA 시약으로 동일 검사를 진행하여 비특이적 반응 가능성을 확인하고 진단시약 간 효능비교를 위한 자료로 활용한다. 국내에는 뎅기바이러스와 동일한 플라비바이러스속의 일본뇌염바이러스가 활동하고 있고 서로 간 혈청학적 교차반응을 일으키는 점을 고려하여 각기 바이러스에 대해 중화시험법을 진행한다. 항체역가는 기준 바이러스의 플라크 수를 90% 감소시킨 혈청희석비(PRNT90%)로 산출하며 항체역가가 4배 이상 높은 쪽의 바이러스에 대해 양성판정을 한다[6].

III. 맺는 말

  본 글에서 기술한 국내감염 뎅기열 의심 사례는 혈청학적 진단법의 "gold standard"로 불리는 플라크감소중화시험법이 진단실험실에 구축되기 전에 발생한 것인데 당시에는 실험실적으로 명확한 결론을 내리지 못하고 의료진의 임상적 판단에 따라 음성으로 판정하였다. 이후 2012년 말에 이르러서야 플라크감소중화시험법을 구축하고 후향적 검사를 수행한 결과 상기 사례 모두 뎅기열이 아닌 것으로 확인되었다. 이에 따라 진단실험실에서는 플라크감소중화시험법을 추가하고 기존의 ELISA 시약을 타사 제품으로 교체하는 등 전반적인 진단프로세스를 개선하였다.

2013년 기준으로 국내에서 뎅기열로 보고된 누적 환자 수는 919명에 이른다. 여기에 불현성 감염과 국가 진단업무 수행 전 감염 사례를 더한다면 실제 환자 수는 훨씬 많을 것이다. 현재 구축된 뎅기열 실험실 진단시스템은 향후 발생할 다른 혈청형 바이러스에 의한 2차 감염사례나 기타 플라비바이러스가 국내에 유입되었을 때에 대응하기에는 부족한 부분이 있다. 그러므로 지속적인 예산투입을 통해 기존 진단법의 개선과 새로운 검사법의 도입이 절실히 요구된다. 제한된 재원의 효율적 활용을 위해 국내에서 발생하는 감염병에 우선적으로 예산을 투입하는 것이 현실적인 방안이겠으나, 본고의 사례에서 살펴본 바와 같이 국내에서 발생하지 않는 감염병에 대해서도 꾸준한 관심과 예산지원이 필요함을 알 수 있다. 특히 뎅기열은 기후변화와 맞물려 매개모기의 서식지와 바이러스의 활동범위가 확대되고 있으며 최근에는 새로운 혈청학적 변이주가 보고되었다.
지속적인 관심과 인적․물적 자원의 투입을 통해 뎅기바이러스를 비롯한 외래 바이러스의 유입을 조기에 감지‧차단할 수 있는 시스템을 구축함으로써 궁극적으로는 국민 보건 향상과 건강 증진에 기여해야 할 것이다.

IV. 참고문헌


1. Laughlin CA, Morens DM, 2012. Cassetti MC. Dengue research opportunities in the Americas. J Infect Dis 206(7):1121-7.
2. WHO (as of 12 May).
www.whoo.int/mediacentre/factsheets/fs117/en
3. Jeong YE, Kim YH, Cho JE, et al. 2011. Identification of Dengue Type 1 Virus (DENV-1) in Koreans Traveling Abroad. Public Health Res Perspect 2(1):34-40.
4. 정영의, 이은주. 2013. 국내 뎅기열 진단실험실의 현황. 주간 건강과질병 6(38):761-765.
5. 법정감염병 진단‧신고기준, 보건복지부 고시 제2012-123호.
6. Robinson JS, Featherstone D, Vasanthapuram R et al. 2010. Evaluation of three commercially available Japanese encephalitis virus IgM Enzyme-linked immunosorbent assays. Am. J. Trop. Med. Hyg. 83(5):1146-1155.