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원인불명 병원체 분석법의 해외 동향
  • 작성일2014-08-28
  • 최종수정일2014-08-29
  • 담당부서감염병감시과
  • 연락처043-719-7166
 원인불명 병원체 분석법의 해외 동향
Identification of Viral Pathogens in Diseases of Unknown Causes Abroad
'
질병관리본부 국립보건연구원 감염병센터 호흡기바이러스과
이한샘, 이준우
Abstract

Background
: Novel emerging infectious diseases have increased due to climate change, environmental pollution, and globalization. Rapid identification of the etiologic agent is imperative for the prevention of diseases from spreading in public health. Thus, the purpose of this report is to survey the rapid identification systems, including the recently developing molecular techniques, to identify the causative agent in cases of unknown infectious illness or outbreaks worldwide.
Methodology: The recent case reports that identified the emerging infectious diseases were searched by using online search programs (PubMed, Google, etc.). Moreover, through the websites of the CDC (USA) and Robert Koch Institute (Germany), their own systems to identify the undiagnosed disease outbreaks were introduced.
Results: This report describes several events in which virus identification is carried out through cell culture/virus isolation, electron microscopy, polymerase chain reaction, and next-generation sequencing. Other useful laboratory methods for diagnosis of an unknown virus include serologic testing; Immunofluorescence assay and immunohistochemistry assays.
Conclusions: As molecular diagnostic techniques are being developed in scope and magnitude, it is critical to retain and use classical techniques as well as new molecular techniques. The rapid combination of cell culture/electron microscopy analysis and new molecular methods including next-generation sequencing is an unbiased approach to the identification of unrecognized pathogen. In addition, the collaboration among clinicians, epidemiologists, microbiologists, electron microscopists, and laboratorians who use different technologies is crucial for the successful investigations of diseases of unknown origin.


I. 들어가는 말


  최근 신종 병원체들이 새롭게 나타나 국가 보건 차원에서 위협이 되고 있으며, 이러한 병원체의 증가 원인으로는 기후 변화, 환경오염, 해외 유동 인구수의 증가 등으로 보고 있다. 특히 호흡기바이러스의 경우, 공기감염으로 빠르게 전파되고, 사람과 동물간의 공통적으로 감염되는 사례가 있기에 신종 호흡기바이러스의 대두는 국가 보건 차원에서 더욱 관심을 가져야 한다. 대표적인 사례로는 2002년에서 2003년에 유행하였던 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus, SARS-CoV), 2008년에서 2009년에 유행했던 신종인플루엔자 바이러스 그리고 최근 2012년부터 현재까지 중동지역에서 유행하고 있는 중동호흡기증후군 코로나바이러스(Middle East Respiratory Syndrome coronavirus, MERS-CoV)가 있다.

이러한 신종바이러스 출현에 대응하기 위해서 각국에서는 원인불명 감염증이 의심되는 환자의 검체로부터 신속히 병원체를 탐지하는 조직 체계를 구성하여 운영하고 있다. 미국의 경우 질병관리본부(Centers for Disease Control and Prevention, CDC) 산하에 Division of High-Consequence Pathogens and Pathology (DHCPP)[1]를 설립하여 운영하고 있으며, 독일의 경우 로버트코흐연구소(Robert Koch institute, RKI) 산하에 Zentrum für Biologische Gefahren und Spezielle Pathogens (ZBS)[2]를 설립하여 신종병원체에 대해 대응하고 있다. 이에 본문에서는 원인불명 병원체의 대응체계에 대한 국외사례들과 원인병원체 규명에 사용되는 최신 면역분자유전학적 분석법을 소개하고자 한다.

II. 몸 말


중증급성호흡기증후군 병원체(SARS) 사례
2002년부터 중국 광동에서 시작된 중증급성호흡기증후군은 짧은 시간 동안 전 세계로 퍼졌으며, 치사율이 9.6%에 이르러 심각한 공포를 조성하였다. 따라서 미국 CDC에서는 원인병원체의 확인을 위해 미국, 홍콩, 싱가포르, 대만, 태국, 캐나다 등에서 확보한 19명의 환자 혈청, 혈액, 조직 등을 활용하여 분석하였다. 이들 검체로부터 각종 호흡기바이러스들(인플루엔자바이러스(Influenzavirus) A와 B, 파라믹소바이러스 아과(Paramyxovirinae), 뉴모바이러스 아과(Pneumovirinae), 아데노바이러스 종(Mastadenoviridae), 헤르페스바이러스 종(Herpetoviridae), 피코나바이러스 종(Picornaviridae), 한타바이러스(hantaviruses), 아레나바이러스(arenaviruses)) 검출을 위한 유전자 진단법(Polymerase chain reaction, PCR)과 세균들(yersinia, mycoplasma, chlamydia, legionella, Coxiella burnetii, spotted fever and typhus group rickettsiae)에 대한 유전자 진단법을 실시하였으나 이러한 방법으로는 원인 병원체를 규명할 수 없어 전형적인 세포배양 동정법으로 원인병원체 분리를 실시하였다.

환자의 혈청, 혈액, 인후도말 등의 검체와 사후 주요 장기 조직들로부터 얻은 샘플을 활용하여 다양한 세포들(Vero E6, NCI-H292, MDCK, LLC-MK2, B95-8 세포)에 접종한 후, 세포병변을 2주간 관찰하였다. 그 결과 19명의 환자 중 46세 환자의 인후도말 샘플이 접종된 Vero-E6와 NCI-H292에서 병변 효과가 나타났으며, 이를 고정 후 전자현미경을 사용한 형태학적 분석을 실시하여 원인병원체가 사람코로나바이러스 계통임을 확인하였다(Figure 1). 그 후, 전체 코로나바이러스(Pan-coronavirus)를 검출을 할 수 있는 유전자 진단법을 신속하게 구축하였고, 이를 활용하여 사스코로나바이러스의 염기서열을 규명할 수 있었다. 또한 환자로부터 분리된 사스코로나바이러스가 감염된 Vero-E6세포를 활용한 항원슬라이드를 제작하였으며, 이를 실제 중증급성호흡기증후군 환자와 정상인의 혈청으로 면역형광분석(Immunofluorescence assay, IFA)에 사용하였다. 마지막으로 면역조직화학 분석법(Immunohistochemistry, IHC)을 사용하여 다른 사람코로나바이러스(OC43, 229E)와 교차 반응분석을 실시하였다. 이외에도 미국 CDC에서는 앞서 언급한 전형적인 분석법 외에 차세대 염기서열 분석법(Next-generation sequencing, NGS)을 통한 원인병원체 분석 연구를 수행하고 있다. 이와 같이 미국 CDC의 Division of High-Consequence Pathogens and Pathology (DHCPP, http://www.cdc.gov/ncezid/dhcpp/)는 원인을 모르는 죽음이나 원인 불명 감염성 질환 그리고 신종 고위험 병원체를 체계적으로 탐지하는 전문화된 시스템을 구축하고 있다.

중동호흡기증후군 병원체(MERS) 사례
2012년 6월, 사우디아라비아의 Jeddah에 있는 병원에 60세의 성인 환자가 호흡기증상(폐렴, 발열, 호흡곤란)으로 입원하였다[5]. 이 환자로부터 채취된 객담과 혈액을 네덜란드의 에라스무스(Erasmus) 대학 내 ViroScience 연구실로 운송한 후. 대학 연구자들은 환자의 객담을 LLC-MK2와 Vero 세포에 각각 접종하여 병변효과를 관찰하였다. 또한 객담에서 상피세포를 분리하여 이를 활용하여 항원슬라이드를 제작하고, 인플루엔자바이러스 A/B, 파라인플루엔자바이러스 type 1-3, 아데노바이러스, 호흡기세포융합바이러스(Respiratory syncytial virus) 등의 항체와 면역형광분석을 실시하였으나 모든 검사결과는 음성으로 판정되었다. 이 후 병원체의 유전물질(DNA/RNA)을 추출하여 파라믹소바이러스, 코로나바이러스, 엔테로바이러스, 아데노바이러스에 대한 유전자 진단법을 실시하였다. 다행히 전체 코로나바이러스 유전자 진단법에서 유전자 증폭 반응이 일어났고, 이 증폭 산물을 통해 일부 염기서열을 알아내었다. 그런 후, Roche 사의 454 GS FLX를 이용한 분리된 바이러스 전장 분석의 성공으로 신종전염병인 중동호흡기증후군의 원인병원체를 동정할 수 있게 하였다[5].

사람 감염 우두바이러스(Cowpoxvirus) 사례
독일 로버트코흐연구소는 바이러스 분리 배양과 전자 현미경 분석법을 통해 동물에게 감염되는 우두바이러스(Cowpoxvirus, CPXV)가 사람에게 감염될 수 있음을 확인하였다[6]. 2008년 독일 Krefeld시 주변에 사는 네 명의 사람과 Landau시의 동물원 근로자에게 심각한 피부병변이 발생하였다. 의사들은 이 피부병변 증상을 수두바이러스(poxvirus)계열의 병원체에 감염되었을 것으로 의심하였고, 이후 로버트 코흐연구소에서 환자의 피부조직에서 분리한 바이러스를 전자 현미경을 사용하여 형태학적 분석을 실시하여 수두바이러스 계통임을 확인하였다. 또한 수두바이러스 항체를 이용한 면역조직화학 분석법과 유전자 진단법을 통해 이 피부질환의 원인병원체가 우두바이러스임을 규명하였다. 이에 전장 염기서열 분석을 통해 이 바이러스를 CPXV HumKre08/1라고 명명하였다. 또한 Krefeld시의 한 동물원에서 13 마리 몽구스가 심한 피부병변을 보였으며, 이들로부터 얻은 피부조직을 전자현미경 분석을 통하여 orthorpoxvirus 계통임을 규명하였고 우두바이러스가 동물로부터 사람에게 공통 감염되었음을 확인하였다(Figure 2).

로버트코흐연구소는 산하에 ZBS 센터를 운영하고 있으며, 이를 통하여 원인불명 병원체에 의한 감염을 신속히 규명하고 있다(Figure 3). ZBS 센터는 총 6개 부서로 조직되어 있고, 기존에 알려진 바이러스나 세균 감염을 진단하는 감염병 센터(Department 1)와 협력하여 운영되고 있다. Department 1에서 동정하지 못한 병원체의 경우, ZBS 센터가 주관하여 규명연구를 실시하게 된다. 6개 ZBS 부서의 역할은 ZBS1이 차세대 염기서열 분석법 및 유전자 진단법(PCR, RT-PCR, real-time PCR)과 항원-항체 반응을 기반으로 하여 전문적으로 조사하며, ZBS4가 전자현미경 분석을 전담하고 있다. 고위험에 속한 세균조사는 ZBS2가 전담하며, 생물학적 독소(단백질, 지질, 당)에 대한 조사는 ZBS3과 ZBS6이 담당하고 있다. ZBS5는 고위험병원체의 관리를 위해 생물안전레벨 4 연구실(Biosafety level-4 lab)을 주관하고 있다.

차세대 염기서열 분석법(NGS)을 활용한 사례
병원체 분리의 고전적인 동정법에는 바이러스 배양 및 전자 현미경을 통한 형태학적 분석 동정법이 있으나, 최근에는 차세대 염기서열 분석법을 활용한 방안이 모색되고 있다. 차세대 염기서열 분석법의 장점은 방대한 양의 염기서열 데이터를 신속하고 효과적으로 분석할 수 있다는 것이다. 그러나 컴퓨터 알고리즘을 잘 구성하여 분석해야 하는 단점이 있다. 예를 들어, ZBS1은 원인불명 병원체의 전장 유전체 확보와 검출을 위해 염기서열을 분석하는 로버트코흐연구소의 Center Sequencing 연구실의 지원을 받고 있다. 이 연구실에서는 Roche/454 FLXT, Ion Torrent PGM, Illumina HiSeq 1500을 보유하고 있어 병원체의 유전자 게놈 분석, Metagenomics, RNA Sequencing, Ultra-deep sequencing등의 업무를 수행하고 있다.

이런 최신 NGS 기술 및 분석을 통해서 Schmallenberg 바이러스[7], Lloviu 바이러스[8], Base-Congo 바이러스[9] 등이 발견되기도 하였다. 원인미상 병원체에 감염된 환자 조직 샘플로부터 병원체 동정을 위해 NGS를 수행하는 체계는 Figure 4의 모식도와 같다(Figure 4)[10]. NGS를 수행하여 획득한 방대한 양의 염기서열 정보들을 맵핑(mapping) 또는 de novo assembly 방식을 통해 400-500 bp 이상의 염기서열 데이터를 형성시킨 후, 미국 National Center for Biotechnology (NCBI)의 Genbank 데이터와 비교 분석하여 새로운 종의 염기서열을 규명하게 된다. 맨 처음 분류는 포유동물 유전자, 곰팡이 유전자, 세균 유전자, 바이러스 유전자 군으로 분류하며, 그 후 세균 및 바이러스 종, 식물 바이러스 종, 포유동물의 바이러스 종으로 나누어 분석을 실시한다. 마지막으로 사람과 동물에게 감염 가능한 포유동물 바이러스들을 다시 분류하여 재분석한다.

III. 맺는 말


  본문에서는 신·변종 감염병의 원인 병원체를 신속히 규명한 해외 연구사례들과 이 때 활용된 병원체 분리 및 배양기술, 전자 현미경을 통한 형태학적 분석법, 그리고 차세대 염기서열 분석법(NGS) 등의 동정 기술에 관하여 소개하였다.
전형적인 세포 배양을 통한 병원체 분류법은 사람보카바이러스처럼 일반적으로 사용되는 세포주에서 배양이 안 되는 병원체의 경우, 동정할 수 없고, 다양한 세포의 배양 및 유지에 많은 노동력이 요구된다. 뿐만 아니라, 실험 수행자의 기술에 의존적이라는 단점도 있다. 더구나 질병에 걸린 환자가 처음 방문하게 되는 지역병원과 보건소에서는 검체채취 및 운송 등의 어려움이 있다. 체외세포 배양조건(In vitro cell culture)에서는 병원체의 복제가 이루어지지 않는 경우도 있어 세포 병변을 관찰하기 힘들며, 신선한 검체임에도 불구하고 병원체의 분리율이 낮게 나오기도 한다. 실제 SARS의 경우, 초기 19명 환자에서 5명의 검체에서만 바이러스가 분리되었다[4].

전자 현미경을 활용한 형태학적 분석법은 실제로 병원체를 직접 관찰할 수 있어 초기 병원체 동정에 큰 도움이 됨에도 불구하고, 많은 양의 샘플들을 처리할 수 없는 단점이 있으며, 일부는 형태학적으로 구분이 힘들어 항체를 이용한 새로운 형태의 분석법이 개발되고 있다. 또한 전문적으로 병원체와 세포의 병변을 판별할 수 있는 경험과 지식을 갖춘 숙련된 연구자가 요구된다[12].
RT-PCR, 실시간 PCR 등을 포함한 유전자 진단법은 세포 배양이 불필요하며 전체 진단과정을 표준화 할 수 있는 장점이 있어 병원체 규명에 가장 많이 사용되고 있으나, 진단 프라이머 제작시 기존에 알려진 병원체의 염기서열을 활용해야 하기 때문에 미지의 병원체 검출에는 한계가 있다. 즉, 신·변종 병원체는 기존에 알려진 염기서열과 상동성이 높지 않기 때문에 유전자 증폭반응에 필수적인 프라이머가 작용하지 않아 검출이 안되는 단점이 있을 수 있다.

그에 반해 NGS법은 염기서열에 비의존적인 SISPA (Sequence-independent, single primer amplification) 유전자 진단법을 사용하므로 전장 염기서열 분석이나 새로운 종의 병원체들을 동정할 수 있다. 그러나 동정된 바이러스가 질환의 직접적 원인인지 판단하기 어렵다. 그러므로 원인병원체의 명확한 규명을 위해 면역형광검색법과 같은 면역분자학적인 방법이 수반되어야 한다.
결론적으로, 원인불명 병원체의 신속한 규명을 위해서는 임상의의 신속한 인지, 면역-분자학적 방법을 활용한 최신 병원체 탐지기술의 지속적인 개발, 이러한 동정법들을 전문적으로 수행 및 분석할 수 있는 전문인력양성 뿐만 아니라, 학계 및 감염병 관련 부서간의 긴밀한 공동 협력 등이 매우 필요하다.

IX. 참고문헌

1. http://www.cdc.gov/ncezid/dhcpp/
2. http://www.rki.de/EN/Content/Institute/DepartmentsUnits/CenterBioSafety/CenterBioSaf ety_node.html;jsessionid=1AFAED7E567775EF93B94A9B6A9E4ACD.2_cid372
3. Goldsmith, C. S, Ksiazek, T. G., Rollin, P. E, et al. 2013. Cell culture and electron microscopy for identifying viruses in diseases of unknown cause, Emerging Infectious Disease. Vol. 19, No. 6, p886-891.
4. Ksiazek T. G., Erdman D., Goldsmith C. S,, et al. 2003. A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome, N. Engl. J. Med. Vol. 348, No. 20, p1953-1966.
5. Zaki, A.M, Boheemen, V, S, Besterbroer, M. T. et al. 2012. Isolation of a Novel Coronavirus from a man with Pneumonia in Saudi Arabia. N. Engl. J. Med. Vol. 367, p1814-1820.
6. Kurth A., Straube M., Kuczka A., et al. 2009. Cowpox Virus Outbreak in Banded Mongooses (Mungos mungo) and Jaguarundis (Herpailurus yagouaroundi) with a Time-Delayed Infection to Humans. PLoS ONE. Vol. 4, No. 9, e6883.
7. Gibbens N. 2012. Schmallenberg virus: a novel viral disease in northern Europe. Vet. Rec. Vol. 170, No. 58. http:dx.doi.org/10.1136/vr.e292
8. Negredo A., Palacious G, Vazquez-Moron S, et al. 2011. Doscovery of an ebolavirus-like filovirus in Europe. PLos Pathog. Vol 7. e1002304.
9. Grard G, Fair J. N., Lee D., et al. 2012. A novel rhadovirus associated with acute hemorrhagic fever in central Africa. PLos Pathog. Vol 8. e1002924.
10. Lysholm, F., Wetterbom A., Lindau C., et al. 2012. Characterization of the viral microbiome in patients with severe lower respiratory tract infections, using metagenomic sequencing. Vol. 7, No. 2, e30875.
11. van Regenmortel M.H. V, Fauquet C.M, Bishop D.H.L, Carstens E.B., Estes M.K., Lemon S.M, et al. 2000. Virus taxonomy: classification and nomenclature of viruses, 7th Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego: Academic Press.
12. Hazelton R. P and Gelderblom, R. H. 2003. Electron microscopy for rapid diagnosis of infectious agents in emergent situations. Emerging Infectious Diseases. Vol. 9, No. 3, p294-303.
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