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병원성 바이러스 자원의 안정적인 장기보관법 확립을 위한 연구
  • 작성일2015-01-15
  • 최종수정일2015-01-20
  • 담당부서감염병감시과
  • 연락처043-719-7166
병원성 바이러스 자원의 안정적인 장기보관법 확립을 위한 연구
Study for Establishment of Stable Long-Term Preservation Method of Viral Pathogen Resource

질병관리본부 국립보건연구원 감염병센터 호흡기바이러스과
김승태, 정향민, 김성순

Abstract


Stable and well-characterized viral resource is essential for the development of vaccine, diagnostic, and therapeutic reagent. Based on the Nagoya Protocol which took effect on November 2014, the importance of viral pathogen resource has been increased.
For the proper use of viral resource, it is necessary to establish stable long-term preservation method without the change of biological properties. Therefore, it is important to determine suitable temperature and efficient cryoprotective additive(CPA) of resource.
To set up the method for long-term storage of virus, two viruses – adenovirus (capsid virus with DNA genome) and measles virus (envelope virus with RNA genome) - were stored and tested in different conditions in which CPA (none, 45% FBS, or 25% sucrose) storage temperature (-20℃ or -70℃) and time (6, 12, 18, 21 and 24 months) were differently applied. The recovery ability and genetic stability using by TCID50 assay and nucleotide sequencing were compared, respectively. As a result, the FBS was more efficient for cryopreservation of virus than sucrose on measles virus at -70℃ during 12 months. On the other hand, the titer of adenovirus was maintained until 6 months under the same condition. Any CPAs have no effect on the protection of both viruses at -20℃.
We expect that these data could be helpful for the guideline for long-term preservation of virus pathogen resource.



Ⅰ. 들어가는 말


2014년 11월 생물다양성의 보존, 생물자원의 지속가능한 이용, 유전자원에 의한 이익 공유를 목적으로 나고야 의정서가 발효되었다. 이에 세계적으로 자국의 생물자원에 대한 해외연구자들의 접근 및 이용의 규제가 강화되었고 국내에서도 생물자원 확보 및 보존을 통한 자원의 축적과 국가적으로 대등한 수준의 생물자원을 유지하기 위한 노력이 요구되고 있다. 병원성 바이러스 및 관련 유전정보는 분자생물학적 연구, 진단, 치료제 및 백신개발 등 생물의약개발을 통한 막대한 부가가치 창출을 위한 기초 자원으로 인정받고 있다. 특히, 중동호흡기증후군 코로나바이러스(MERS-CoV), 에볼라바이러스(Ebola virus) 등 최근 세계적으로 신종 및 재출현 병원성 바이러스가 빈번하게 발생하고 있으며, 국제적 이동인구의 증가로 인해 신·변종 병원체가 급속하게 전파될 수 있어 진단, 백신 및 치료제의 개발과 배제진단 표준물질로서 활용할 수 있는 다양한 병원체 바이러스 자원 확보의 중요성이 강조되고 있다.

병원성 바이러스가 자원으로 활용되기 위해서는 기본적으로 유전적, 형태적 및 혈청학적 특성이 분석되어 있어, 자원의 사용자가 필요로 하는 조건의 자원을 선택하여 이용할 수 있어야 하며, 해당 바이러스 자원의 특성이 안정적으로 장기간 유지될 수 있어야 한다. 특히, 특성이 분석된 바이러스 자원을 장기간 안정적으로 보관하는 것은 바이러스 자원의 신뢰성과 활용도를 향상시키기 위한 필수조건이다. 바이러스 자원은 세균·진균 등의 자원과 달리 바이러스의 숙주 의존성으로 인해 바이러스 증식을 위한 배양이 필요하며, 세포 등을 이용한 인공배양 횟수가 증가함에 따라 변이체를 형성할 수 있어서 세포에 대한 감수성이 변하는 등의 문제가 발생될 수 있다. 그러므로, 바이러스 자원의 상동성을 유지하기 위해서는 낮은 계대의 바이러스를 장기간 보관하는 것이 중요하다[1-3].

바이러스 장기 보관을 위해서 동결건조(freeze-drying, lyophilize)법과 동결(freezing)법이 이용되고 있다. 동결건조법의 경우 50년 이상의 장기보관이 가능한 것으로 알려져 있지만, 조작이 복잡하고 바이러스의 감염성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있어, 감염성을 불활화시킨 백신의 보관에 주로 사용되고 있다[4]. 동결법은 병원성 바이러스의 보관에 일반적으로 사용되며, 바이러스 배양액을 낮은 온도(-70℃)에서 보관하는 방법이다. 일반적으로 보존제의 첨가 없이 바이러스 배양액 자체를 급속하게 냉동하는 방법을 사용하고 있다[2, 3]. 특정 바이러스의 경우 동결법을 이용하여 바이러스를 보관하였을 때 바이러스의 역가가 급격하게 감소한다는 연구 결과가 보고된 바 있으나[5], 온도 및 보존제 첨가 여부 등 동결 조건에 따른 바이러스의 생존율에 대한 체계적인 연구는 미비한 실정이다.

본 연구에서는 국내에서 분리되고 특성이 분석된 홍역 바이러스 및 아데노바이러스를 이용하여 보존제의 유무, 보관 온도 및 기간에 따른 역가 및 유전적 안정성을 비교 분석하였다. 이중 본 글에서는 전체 2년의 보관 기간 중 1년 동안 수행한 실험결과를 통해 바이러스 장기 보관법에 대해 살펴보고자 한다.

Ⅱ. 몸말


국내에서 분리된 홍역 바이러스(measles virus)와 아데노바이러스(adenovirus)를 이용하여 장기보관조건에 따른 안정화 실험을 진행하였다(Table 1). 홍역 바이러스는 단일 혈청형이나 24가지 유전형을 가진 바이러스로서, 단일가닥 RNA 유전자로 구성되어 있으며, 바이러스 표면에 당단백질과 지질로 이루어진 피막(envelope)을 가진 구형의 바이러스이다. 홍역 바이러스는 다른 바이러스에 비해 상대적으로 산, 단백질분해효소, 온도와 습도 등에 매우 민감하여 37℃에서 2시간 방치되었을 경우 감염력은 절반으로 줄어들고 56℃에서 30분간 방치하면 완전히 불활성화되는 것으로 알려져 있다. 아데노바이러스는 57가지의 혈청형으로 구분되며, 유전자가 이중가닥 DNA로 이뤄져 있고 바이러스 표면은 지질층 피막이 없고 240개의 캡소머(capsomere)와 12개의 펜톤(penton)이 캡시드(capsid)를 형성하여 정 20면체 모양을 가지고 있다. 이런 캡시드 구조에 의하여 유기용매에 내성을 나타낸다[6].

바이러스의 냉동 보존제(cryo-protective additive, CPA)는 황산화합물(sulfoxide) 계열의 dimethyl sulfoxide(DMSO)와 이당류(disaccharides)계열의 sucrose, 3가 알코올(triol) 계열의 글리세롤(1,2,3-propanetriol, glycerol), 단백질 및 펩타이드(proteins and peptides) 계열의 fetal bovine serum(FBS)이 주로 이용되고 있다. 이중 DMSO는 세포에 독성이 있고, glycerol은 일부 바이러스 및 박테리아에 독성이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, FBS 및 sucrose의 경우 바이러스 및 세포에 독성이 없는 것으로 알려져 있다[1]. 본 연구대상인 홍역과 아데노바이러스 냉동 보관에 효과적인 보존제에 대한 연구결과는 확인할 수 없었으나, 사람 호흡기세포융합바이러스(human respiratory syncytial virus, HRSV)의 경우 여러 보존제 중 45% FBS와 25% sucrose가 가장 좋은 보존 효과를 보인다는 연구 결과를 참조하여[5], 본 실험에서는 45% FBS와 25% sucrose를 CPA로 선정하여 사용하였다.

바이러스의 역가를 확인하기 위해서 plaque assay법, tissue culture infectious dose 50%(TCID50) assay법, quantitative PCR법을 사용할 수 있다. Quantitative PCR법은 바이러스 특이 핵산의 양을 측정하는 방법으로 신속하게 시료 내 바이러스의 양을 확인할 수 있으나 바이러스의 생존여부 및 감염 가능성을 확인할 수 없어 역가 확인에는 부적절한 것으로 보인다. Plaque assay법과 TCID50 assay법은 바이러스를 세포에 접종 후 생성되는 세포병변효과(cytopathic effect, CPE)를 기준으로 바이러스의 역가를 확인하는 방법이다. 홍역바이러스와는 달리 아데노바이러스의 경우 TCID50 assay법이 plaque assay법 보다 역가확인에 용이하여, 본 실험에서는 TCID50 assay법을 이용하여 바이러스의 역가를 측정하였다. 바이러스 보관 전 바이러스의 역가를 측정한 후 각각 다른 보관온도(-20℃, -70℃) 및 보존제(보존제 미첨가, 25% sucrose, 45% FBS) 조건에 따라 보관하였으며, 각 조건에서 6, 12개월 후 역가를 측정하여 비교 분석 하였다.

또한, 바이러스의 보관에 따른 생물학적 특성 변화를 측정하기 위하여 바이러스 보관 전·후 주요 유전자의 염기서열을 비교 분석하였다. 유전자 염기서열 분석에 사용된 프라이머와 대상 유전자는 Table 2와 같다. 홍역 바이러스의 경우 유전형 분류 시 사용되는 nucleocapsid 유전자 염기서열을, 아데노바이러스는 혈청형 확인을 위한 hexon 유전자의 염기서열을 비교하였다. 바이러스 역가 확인 실험은 3회 반복(triplication) 실시하고 각 실험값의 평균을 이용하여 결과를 작성하였으며, 유전자 염기서열은 각 보관조건에서 3회 확인하여 동일한 결과를 얻었다.

홍역바이러스의 역가는 -20℃, 보존제 미첨가 조건에서 6개월과 12개월 보관 시 각각 초기 역가에 비해 약 20%와 0.4%로 감소되었다. 그러나 45% FBS가 첨가된 조건에서는 초기 역가와 비교 시 약 1%와 0.4% 정도로 감소되었으며, 25% sucrose 조건에서는 약 11%와 7%로 감소하였다. 아데노바이러스의 경우 -20℃에서 6개월간 보관하였을 때, 보존제가 첨가되지 않은 경우 초기 역가의 약 2% 수준으로 감소하였으며, 45% FBS를 첨가하였을 때는 약 31%, 그리고 25% sucrose 첨가 시에는 약 2% 수준으로 역가가 감소하였다. 아데노바이러스를 -20℃에서 12개월간 보관하였을 때는 보존제에 따른 모든 조건에서 초기 역가의 1% 미만 수준으로 많은 감소를 보였다.

보관온도 -70℃에서 보존제에 따른 바이러스의 역가 변화를 보면, 홍역 바이러스의 경우 보존제가 첨가되지 않은 상태에서 6개월 및 12개월간 보관하였을 때 약 50%의 역가 감소를 보였으나, 45% FBS가 첨가된 경우에는 역가가 감소되지 않았다. 25% sucrose 첨가 시에는 역가가 6개월 까지는 약 95% 유지되었으며, 12개월간 보관 시에는 초기값의 약 60%로 역가가 감소되는 것을 확인하였다. 같은 조건에서 아데노바이러스는 6, 12개월간 보관 시 보존제 미첨가 조건에서 각 역가의 약 35%와 10%로 감소되었으나, 45% FBS 첨가 조건에서는 역가가 약 90%와 40%, 25% sucrose 첨가 조건에서는 약 80%와 30%로 상대적으로 잘 보존되었다(Table 3, Figure 1).

보관기간 동안 보관 온도 및 보존제 유무에 의한 바이러스의 역가 변화 이외에 생물학적 특성의 변화 여부를 확인하기 위하여, 홍역 바이러스 유전형 분류에 이용되는 nucleocapsid(N) 유전자와 아데노바이러스 혈청형 구분에 이용되는 hexon 유전자를 각 유전자 특이 primer로 증폭 후 Sanger method를 이용하여 염기서열을 확인하였다. 유전자 염기서열 분석 결과, 6, 12개월의 보관기간 및 보관온도(-20℃, -70℃), FBS, sucrose의 첨가 유무 등 바이러스 역가측정과 동일한 환경에서 역가의 변화와 상관없이 바이러스 주요 유전자의 염기 서열에서 유전적 변이가 발견되지 않았다(Table 4).

Ⅲ. 맺는말

병원성 바이러스 자원의 안정적인 보관법 확립을 위하여, 서로 다른 특성을 가지는 홍역 바이러스(단일가닥 RNA, envelope 바이러스)와 아데노바이러스(이중가닥 DNA, capsid 바이러스)를 이용하여 보관온도 및 보존제에 따른 바이러스의 역가 및 주요 유전자 변이여부를 확인하였다. 보관온도를 기준으로 바이러스 역가를 확인한 결과 -20℃ 보다 -70℃에서 바이러스를 보관하였을 때 바이러스의 역가가 잘 유지되었다. 보관온도 -20℃의 경우 12개월간 보관하였을 때 보존제 유무와 상관없이 모두 역가가 매우 낮은 것으로 확인되어 -20℃에서 바이러스를 보관하는 것은 적합하지 않음을 알 수 있었다.

또한, 보관온도 -70℃조건에서 45% FBS를 첨가하는 것이 바이러스 보관 시 최적 조건으로 나타났다. 특히, 홍역 바이러스는 동 조건에서 바이러스 역가가 12개월간 약 100%로 유지되었다. 아데노바이러스도 -70℃, 45% FBS 첨가 조건에서 역가 감소가 적은 것으로 확인하였으나, 모든 보존제 조건에서 보관기간에 비례하여 바이러스의 역가가 지속적으로 낮아졌다. 추후 1년간의 실험자료가 확보되면 홍역 및 아데노바이러스의 계대 배양주기 및 최적보관조건 확립에 의미 있는 결과가 도출될 수 있을 것으로 사료된다. 향후 보다 효율적인 보관 조건 확립을 위하여 액체 질소 보관 및 다른 계열 보존제에 대한 추가 실험이 필요할 것으로 사료된다.

본 연구 결과와 향후 1년의 연구결과를 이용하여 병원성 바이러스 자원 역가의 보증기간 및 보관조건에 대한 가이드라인을 제시할 수 있을 것이며, 이를 통해 병원성 바이러스 자원의 신뢰성과 활용도 향상에 기여할 수 있을 것으로 본다.

Ⅳ. 참고문헌


1. Hubalek Z. 2003. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology 46:205-229.
2. Gould EA. 1999. Methods for long-term virus preservation. Mol Biotechnol. 13(1):57-66.
3. Tedeschi R, De Paoli P. 2011. Collection and preservation of frozen microorganisms. Methods Mol Biol. 675:313-326.
4. Klein F, Walker JS, Mahlandt BG, Carter RC, Orlando MD, Weirether FJ, Lincoln RE. 1969. Interacting factors that influence long-term storage of live Pasteurella tularensis vaccine and Rift Valley fever virus. Appl Microbiol. 17(3):427-434.
5. Guptai C K, Leszczynski J, Gupta R K. Siber G R. 1996. Stabilization of respiratory syncytial virus (RSV) against thermal inactivation and freeze-thaw cycles for development and control of RSV vaccines and immune globulin. Vaccine. 14(15):1417-1420
6. 질병관리본부. 2005. 감염병실험실 진단.
7. World Health Organization. 2006. GUIDELINES ON STABILITY EVALUATION OF VACCINES.
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