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탄저균 DNA에 의한 탄저독소의 대식세포 독성 증가
  • 작성일2015-03-26
  • 최종수정일2015-03-26
  • 담당부서감염병감시과
  • 연락처043-719-7166
탄저균 DNA에 의한 탄저독소의 대식세포 독성 증가
Bacillus anthracis DNA Potentiates The Lethal Toxin-Induced Cytotoxicity to Macrophages


질병관리본부 국립보건연구원 병원체방어연구과
전준호, 김연희, 이해리, 김유리, 전정훈, 이기은

Abstract


Background: Bacillus anthracis is a Gram-positive, spore-forming bacterium causing anthrax. Lethal toxin (LT) produced by B. anthracis is a well-known key virulence factor for anthrax because of its strong cytotoxic activity to the host phagocytes such as macrophages. However, little is known about the role of B. anthracis genomic DNA (BAG) in anthrax pathogenesis.
Methods: The effect of BAG on TNF-α production was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in the mouse macrophage cell line, RAW 264.7 cells and bone marrow-derived macrophages from BALB/c mice. The influence of BAG and TNF-α on LT cytotoxicity was evaluated by MTT assay in the cell-line, J774A.1. The effect of BAG on LT-mediated lethality was determined by examining the survival rates of mice.
Results: BAG led to TNF-α expression in a dose- and time-dependent manner when treated to RAW 264.7 cells. TNF-α expression induced by BAG was reduced by transfection with TLR9 siRNA. Furthermore, BAG-induced TNF-α production in macrophages was completely abrogated in TLR9−/− macrophages. Treatment with BAG alone showed no cytotoxic activity on the macrophage cell-line J774A.1, whereas LT-mediated cytotoxicity was enhanced by treatment with BAG or TNF-α. Enhanced LT-induced lethality was also confirmed by BAG administration in mice. Furthermore, LT plus BAG-mediated lethality was significantly recovered by administering Infliximab, an anti-TNF-α monoclonal antibody.
Conclusions: Our results suggest that B. anthracis DNA may contribute to anthrax pathogenesis by enhancing the cytotoxic activity of LT via TLR9-mediated TNF-α production.


I. 들어가는 말


  탄저(anthrax)는 그람양성의 포자를 형성하는 비운동성의 막대균인 탄저균(Bacillus anthracis)의 감염에 의해 발병되는 인수공통 감염병 이다[1,2]. 탄저균은 보통 포자의 형태로 토양에 존재하므로 탄저는 소, 말, 양, 염소 등과 같은 초식동물에서 1차적으로 발생된다. 사람의 경우 탄저균에 감염된 동물과 접촉하거나 섭취하였을 경우 2차적으로 발생될 수 있다. 탄저는 감염경로에 따라 피부탄저(cutaneous anthrax), 호흡기탄저(pulmonary anthrax), 위장관탄저(gastrointestinal anthrax)로 구분된다[3,4].

탄저포자가 여러 경로를 통하여 숙주에 들어가게 되면 대식세포(macrophages)에 의해 포식되어, 가까운 림프절로 이동하고 대식세포 내에서 발아가 이루어져 영양세포(vegetative cells)가 된다[1,2]. 이러한 영양세포는 다시 세포 밖으로 나와 활발하게 증식하며, 이 과정에서 탄저균은 치사인자(lethal factor)와 부종인자(edema factor) 그리고 방어항원(protective antigen)을 분비한다[3,4]. 치사인자와 방어항원은 서로 결합하여 치사독소(lethal toxin)를 형성하며 숙주세포의 사멸 및 장기부전(organ failure)을 유도함으로써 최종적으로 숙주를 죽음에 이르게 한다[3,4]. 이와 달리, 부종인자와 방어항원은 서로 결합하여 숙주에서 부종을 일으키는 부종독소(edema toxin)를 형성한다[3,4].

탄저균의 치사독소에 의한 숙주세포의 사멸이 탄저균의 주된 병인기전으로 알려졌으나 최근에 탄저균의 poly-γ-D-glutamic acid 캡슐과 세포벽 구성성분인 펩티도글라이칸(peptidoglycan)이 치사독소에 의한 숙주세포의 사멸을 증대시킬 수 있음이 보고되었다[5]. 하지만, 이외의 다른 인자들이 탄저균의 병인기전에 관여하는지는 알려져 있지 않다.

본 글에서는 탄저균 DNA가 대식세포에서 TNF-α 생산을 유도하고, 치사독소에 의한 세포사멸 및 마우스 치사율을 증대시키는 효과에 대하여 기술하고자 한다.

II. 몸 말


  병원성 미생물이 숙주에 침입하게 되면 대식세포와 수지상세포와 같은 선천성 면역세포는 패턴인식수용체(pattern-recognition receptors)를 통하여 미생물 특이 분자구조(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)를 인식함으로써 침입한 미생물에 대응하게 된다[6]. 가장 잘 알려진 패턴인식수용체 중 하나가 toll-like receptors (TLR)로 박테리아와 바이러스와 같은 미생물의 다양한 PAMP를 인식하여 숙주에서 면역반응을 유도한다[6]. 현재까지 알려진 PAMP 중 일부 미생물의 DNA는 대식세포를 포함한 다양한 면역세포를 활성화 시킬 수 있음이 보고되었으며, 이러한 능력은 포유동물의 DNA에 비하여 unmethylated CpG sequence 함량이 높기 때문인 것으로 알려져 있다[7]. 또한 미생물의 DNA는 현재 TLR family 중에서 TLR9을 통하여 숙주에서 면역반응을 유도할 수 있음이 보고되었다[7].

본 연구에서는 먼저 탄저균의 DNA가 숙주 대식세포를 활성화시켜 염증성 싸이토카인을 유도할 수 있는지를 알아보았다. 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 탄저균의 DNA를 농도별로 처리하고 RNA와 단백질 수준에서 TNF-α의 발현변화를 확인하였다. 탄저균 DNA는 RAW 264.7 세포에서 TNF-α의 발현을 mRNA와 단백질 수준에서 농도 및 시간 의존적으로 증가시킴을 확인하였다(Figure 1).

탄저균 DNA가 마우스 대식세포주를 활성화시켜 TNF-α 발현을 유도할 수 있음을 확인하였으므로 이 현상이 미생물 DNA를 인식하는 수용체로 알려진 TLR9을 통하여 일어나는지를 알아보기 위하여 TLR9에 대한 siRNA를 RAW 264.7 세포에 도입하여 TLR9 발현을 억제시키거나 TLR9을 보유하고 있는 대식세포와 결손된 대식세포에 탄저균 DNA를 처리한 후 TNF-α의 생산량을 비교하였다. siRNA를 이용하여 TLR9 발현을 억제하였을 경우 탄저 DNA에 의해 유도되는 TNF-α의 생산량이 현저히 감소됨을 확인할 수 있었다(Figure 2A). 이와 더불어 TLR9을 보유하고 있는 대식세포에서 탄저균 DNA는 TNF-α 생산을 유도하였으나 TLR9이 결손된 대식세포에서는 TNF-α 생산을 유도하지 못함을 확인할 수 있었다(Figure 2B). 따라서 탄저균 DNA에 의한 TNF-α 생산은 TLR9 의존적임을 확인할 수 있었다.

탄저균의 DNA가 치사독소에 의한 세포사멸에 미치는 영향을 알아보기 위하여 마우스 대식세포인 J774A.1 세포에 치사독소와 함께 탄저균 DNA를 농도별로 처리하였다. 그 결과 탄저균 DNA는 농도 의존적으로 치사독소에 의한 세포사멸을 증대시킴을 확인할 수 있었다(Figure 3A). 이와 함께 탄저균 DNA에 의한 치사독소 세포사멸 증대효과가 탄저균 DNA자극에 의하여 세포에서 분비되는 TNF-α 때문인지를 알아보기 위하여 세포에 TNF-α를 전 처리 한 후 치사독소를 처리하였다. 치사독소에 의한 세포사멸은 처리한 TNF-α 농도에 의존적으로 증가됨을 확인할 수 있었다(Figure 3B).

탄저균 DNA가 치사독소에 의한 세포사멸을 증대시킬 수 있음을 확인하였으므로 마우스모델에서도 치사독소의 효과를 증대시킬 수 있는지를 조사하였다. 마우스에 치사독소만을 투여하였을 경우 50%의 마우스가 생존하였으나 탄저균 DNA와 함께 주입 시에는 생존률이 8%로 감소되었다. 또한 탄저균 DNA에 의한 치사율의 증가에 TNF-α가 관여하는지를 확인하기 위하여 TNF-α에 대한 억제효과가 있는 단클론항체인 Infliximab을 투여하였을 경우 치사독소에 의한 마우스 생존률이 8%에서 75%로 높아짐을 확인할 수 있었다(Figure 4).

본 연구를 통하여 확인한 탄저균 DNA의 탄저 병인기전에서의 역할에 대해 종합적으로 정리하면 다음과 같다. 대식세포가 탄저포자에 감염 될 경우 탄저균의 DNA는 숙주의 패턴인식수용체인 TLR9에 의하여 인식되게 되고 다양한 신호전달 과정을 통하여 TNF-α의 생산을 유도하며, 탄저 DNA 등 다양한 병독성 인자에 의해 생산된 TNF-α는 치사독소에 의한 마우스의 치사율을 증대시키게 된다(Figure 5).

III. 맺는 말



본 연구에서는 탄저균의 감염과정동안 탄저균의 DNA가 TLR9을 통하여 인식되어 마우스 대식세포를 활성화시키고, 이를 통하여 면역세포 활성화 관련 싸이토카인인 TNF-α의 생산을 유도할 수 있음을 확인하였다. 이와 더불어, 탄저균 DNA에 의해 유도된 TNF-α는 치사독소에 의한 대식세포 사멸 및 마우스의 치사율을 증가시킴을 증명하였다. 본 연구결과를 통하여 확인된 TNF-α 억제에 의한 마우스 치사율 감소효과는 향후 추가적인 연구를 통하여 탄저 치료제 개발을 위한 기반자료로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

Ⅳ. 참고문헌


1. Goel A. K. 2015. Anthrax: A disease of biowarfare and public health importance. World J. Clin. Cases 3(1):20-33
2. Sweeney D. A. et al., 2011. Anthrax Infection. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184:1333-1341.
3. Swartz M. N. 2001. Recognition and management of anthrax-an update. N. Engl. J. Med. 345(22): 1621-1626.
4. Ingelsby T. V. et al. 2002. Anthrax as a Biological Weapon, 2002. Updated Recommendations for Management. J.A.M.A.288(17):2236-2252.
5. Jeon J. H. et al. 2014. Bacillus anthracis genomic DNA enhances lethal toxin-induced cytotoxicity through TNF-α production. BMC microbiol. 14:300
6. O'Neill L. A. et al. 2013. The history of Toll-like receptors-redefining innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 2013. 13(6):453-460.
7. Hemmi H. et al. 2000. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature 408(6813):740-745.
8. Liu S. et al. 2014. Anthrax lethal and edema toxins in anthrax pathogenesis. Trends Microbiol. 22(6):317-325.


본 원고는 BMC microbiology 2014 14(1): 300에 게재된 논문의 재편집을 통해 작성되었습니다.
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