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인간 면역결핍 바이러스 감염 연구를 위한 인간화 생쥐 개발 현황 소개
  • 작성일2015-05-28
  • 최종수정일2015-05-28
  • 담당부서에이즈·종양바이러스과
  • 연락처043-719-7166
인간 면역결핍 바이러스 감염 연구를 위한 인간화 생쥐 개발 현황 소개
Introduction of Improved Humanized Mouse Models for Human Immunodeficiency Virus Research

질병관리본부 국립보건연구원 면역병리센터 에이즈·종양바이러스과
임호용, 김경창, 강 춘

Abstract

The fact that Human Immunodeficiency Virus (HIV) cannot infect rodent cells has been a major hurdle in developing preventive or therapeutic interventions against HIV infection in vivo using experimental murine models. To overcome this limitation, investigators have developed several ‘humanized’ mouse models in which human leukocytes can survive and expand by transplanting human lymphoid cells and tissues. HIV has been shown to be able to successfully infect human immune cells in these humanized mice. Furthermore, HIV-infected humanized mice exhibit (i) reduced human CD4+ T cell number in the peripheral blood and lymphoid organs, (ii) nonspecific immune activation, and (iii) increased viral RNA levels in plasma, all of which are also found in HIV-infected human patients. To generate humanized mice, immuno-deficient mouse strains served as a platform because these mice are known to accept xenograft due to the lack of host immune cells that induce graft rejection. This paper discussed the current understanding of immuno-deficient mice and recent advances in humanized mouse models in HIV/AIDS research.


I. 들어가는 말

  세계보건기구에서 발표한 자료에 따르면 전 세계적으로 지금까지 6천만 명 이상의 사람들이 인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV)에 감염되었으며, 그 중 절반에 가까운 사람들이 후천성면역결핍증(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)에 따른 질병에 의해 사망한 것으로 추산된다. HIV에 감염된 사람을 치료하고 전염을 막기 위하여 안전하고 효과적인 백신(vaccine) 개발이 시급하지만 지난 30여 년간의 집중적인 연구와 투자에도 불구하고 효과적인 치료법이나 예방백신은 아직 개발되지 않아 해마다 막대한 사회적 비용이 발생되고 있다.
일반적으로 백신과 같은 의약품 개발을 위해서는 소동물을 이용한 기초 연구와 전임상 시험이 필요하지만 생쥐와 같은 설치류(rodent)의 세포에는 HIV가 감염되지 않아 일반 생쥐를 이용한 HIV 연구는 사실상 불가능하다. 그러나 HIV에 대한 연구가 시작된 이 후 연구자들은 이러한 한계점을 극복하고자 사람의 면역 체계를 생쥐에 도입한 인간화 생쥐(humanized mouse)를 제작하였으며 지금까지 여러 문제점들을 개선한 인간화 생쥐들이 계속 개발되고 있어 HIV 감염질환 연구 및 새로운 치료법 개발에 대한 기대가 증대 되고 있다.

이 글에서는 HIV/AIDS 연구와 치료법 개발을 위해 현재 사용되고 있는 인간화 생쥐에 대해 소개하며 인간화 생쥐 제작 과정을 이해하는데 필요한 몇 가지 내용들을 기술하고자 한다.

II. 몸 말

  외부 병원체로부터 우리 몸을 방어하는 면역계(immune system)는 각자 맡은 역할이 조금씩 다른 다양한 종류의 면역세포로 구성되어 있다. 대식세포(macrophage)나 호중구(neutrophil)와 같이 선천성 면역반응(innate immune response)을 일으키는 세포들은 일반적으로 병원체에 대해 즉각적으로 반응하여 이를 제거(clearance) 하게끔 진화되어 있다. 선천성 면역반응은 빠르게 일어난다는 장점은 있으나 특이성이 낮다는 단점이 있어 모든 병원체를 막아 낼 수는 없다. 따라서 각각의 병원체 정보에 기반을 둔 맞춤형 면역반응이 그 뒤에 일어나는데 이를 후천성(혹은 획득성) 면역반응(adaptive or acquired immune response)이라 한다. 후천성 면역반응에서 핵심 축을 이루는 면역세포들 중 대표적인 T 세포는 다양한 병원체 특징에 맞는 대응력을 갖기 위해 분화라는 과정을 거친다. 그렇기 때문에 후천성 면역반응이 일어나기 위해서는 대체로 수일 이상의 시간이 필요하다. T 세포는 원래 골수(bone marrow)에서 생성 되지만 흉선(thymus)에서 성숙 과정이 일어나기 때문에 사실상 T 세포가 만들어지는데 가장 중요한 기관은 흉선이라 할 수 있다.

T 세포는 세포 표면에 존재하는 특정 단백질의 종류에 의해 구분이 가능한데 CD4라는 단백질이 있으면 보조 T 세포(이하 CD4+ T 세포로 표시함)로, CD8 단백질이 존재하면 세포독성 T 세포(이하 CD8+ T 세포로 표시함)로 구분되며 서로 맡은 역할이 다르다. CD4+ T 세포의 경우 CD8+ T 세포와 달리 직접 다른 세포를 죽이지는 않지만 B 세포에서의 항체생성 활성화, CD8+ T 세포 및 대식세포의 활성화 등 다양한 면역세포의 기능을 조절하는 역할을 담당하기 때문에 전체적인 면역반응의 다양성 및 기억(memory) 면역반응의 획득에 있어 매우 중요하다. 따라서 CD4+ T 세포가 결핍된 경우 감염에 효율적으로 대처하지 못하는 면역결핍 현상이 초래될 수 있다. HIV가 특이적으로 이 CD4+ T 세포에 감염되어 일정 기간이 지나면 체내의 CD4+ T 세포의 수가 급격하게 감소되며 이로 인해 후천성 면역반응이 제대로 일어나지 않게 되는데 이러한 증상을 후천성면역결핍증(AIDS)이라 한다. 사람의 면역세포에 감염되는 HIV의 특성상 관련 연구를 수행하기 위해서는 사람을 대상으로 해야 하지만 현실적으로 쉽지 않기 때문에 HIV/AIDS 연구에 사용할 목적으로 사람의 면역체계가 도입된 인간화 생쥐가 개발 되어졌다.

인간화 생쥐는 면역성이 결여된 생쥐(immunodeficient mouse)에 사람의 세포 혹은 조직을 이식하거나 유전자를 도입시킨 연구용 생쥐로 간단히 정의할 수 있다[1]. 면역성이 결여된 생쥐를 사용하는 이유는 정상적인 생쥐에서는 사람의 조직 혹은 세포가 이식되면 곧바로 거부반응(graft rejection)이 발생하고, 사람의 유전자에 의해 만들어진 단백질 또한 생쥐의 체내에서 외부 항원으로 간주되어 부작용을 일으키기 때문이다.
인간화 생쥐를 제작하려면 면역성이 결핍된 생쥐에 인간의 면역 체계를 도입시켜야 하는데 이를 위하여 다음과 같은 방법 등이 사용되고 있다(Figure 1)[2]. 첫 번째는 사람의 조혈모세포(human hematopoietic stem cells, hu-HSC)를 이식하는 방법이다. 태반 혈액(cord blood) 또는 간 조직 등으로부터 얻어지는 조혈모세포는 세포 표면에 CD34라는 단백질이 있어 다른 세포와 구분되어 쉽게 분리될 수 있고 미분화 상태이기 때문에 생쥐 체내 환경에 따라 여러 면역 세포로의 분화가 가능하다. 두 번째는 사람의 말초 혈액에 존재하는 백혈구(human peripheral blood leukocytes, hu-PBL)를 분리하여 생쥐에 주입하는 방법이며, 세 번째 방법은 방사선 조사(irradiation)로 골수가 파괴된 면역결핍 생쥐에 사람의 골수, 흉선 및 간과 같은 조직을 이식하는 것으로써 일반적으로 BLT (Bone marrow/Liver/Thymus)로 줄여서 부르기도 한다. 네 번째는 경우에 따라 위 세 가지 방법을 혼용하는 것이다. 조혈모세포나 BLT 조직이 이식된 인간화 생쥐에서는 비교적 사람과 유사한 면역 체계와 안정성이 관찰 되지만, 이식할 조혈모세포나 조직을 사람으로부터 얻기 힘들다는 것과 생쥐의 체내에서 생착(engraftment)되기까지 시간이 오래 걸린다는 단점들이 있다. 사람의 말초 혈액에서 얻어진 백혈구를 이식하는 방법은 상대적으로 간단하며 빠른 시간 내에 생착된다는 장점은 있으나 면역세포의 종류가 한정적이며 지속적으로 체내에서 생성되기 어렵다는 단점도 가지고 있다. 따라서 이러한 장단점을 고려하여 연구 목적에 맞는 인간화 생쥐 모델을 선택하는 것이 필요하다. 아래에서는 실제로 개발되어 사용되고 있는 인간화 생쥐에 대한 내용을 다루고자 하며, 아울러 인간화 생쥐를 이용한 HIV 관련 연구에 대해서도 간략히 소개하고자 한다.

인간화 생쥐 제작의 초기 역사
  인간화 생쥐 제작의 초창기라고 할 수 있는 1980년대 초반, 사람의 면역체계를 생쥐에 도입시키기 위해 연구자들은 ‘털 없는 생쥐(nude mouse)’에 인간의 골수 세포를 주입하는 방법을 사용하였다. 털 없는 생쥐를 선택한 이유는 이 생쥐에는 흉선이 없어 T 세포가 존재하지 않기 때문이었다. 그러나 기대했던 만큼의 좋은 결과는 얻지 못하였는데 그 이유는 B 세포와 자연살해세포(natural killer cell, NK cell) 등 다른 면역세포들에 의해 거부반응이 일어났기 때문이었다[3]. 다음으로 진행된 인간화 생쥐 개발은 1980년대 후반에 진행되었던 스키드(Severe Combined Immunodeficiency, SCID) 생쥐를 이용한 것이었으며 이 생쥐는 유전적 결함 때문에 T 세포와 B 세포가 모두 결핍되어 있다[4]. 이 생쥐에 인간의 말초혈액 백혈구(PBL) 또는 인간의 흉선/간(Thymus/Liver) 조직을 이식해 본 결과, 비교적 성공적으로 인간의 면역 세포들이 생쥐 체내에 생착되는 것이 관찰 되었다(각각 SCID-hu PBL, SCID-hu Thy/Liv로 표시함). 그러나 SCID 생쥐에도 자연살해세포와 대식세포 등 거부반응을 일으킬 수 있는 면역세포들이 여전히 존재하고 있는 문제점이 있었다. 그래서 비-비만성 당뇨병(Non-Obese Diabetic, NOD) 생쥐와 스키드 생쥐를 교배하여 얻은 NOD-SCID 생쥐를 사용하게 되었는데 이 생쥐에는 T 세포와 B 세포뿐만 아니라 자연살해세포와 대식세포가 결핍되어 있어 인간화 생쥐 제작에 보다 적합하였다[5]. SCID 생쥐 이외에도 T 세포와 B 세포가 결핍된 생쥐로는 rag1 유전자가 제거된 rag1 knock-out (rag1-/-로 표시함) 생쥐가 있으며 NOD-SCID 생쥐처럼 NOD 생쥐와 교배시킨 NOD-rag1-/-생쥐도 만들어졌다. NOD-SCID 혹은 NOD-rag1-/-생쥐를 기반으로 한 인간화 생쥐 제작 이후에도 면역학이 비약적으로 발전함에 따라 거부반응을 포함한 여러 면역반응의 원리가 밝혀지게 되었고 이는 더욱 향상된 인간화 생쥐 제작의 밑거름이 되었다.

인간화 생쥐 제작의 발전
  NOD-SCID와 NOD-rag1-/-생쥐는 인간화 생쥐 제작에 있어서 많은 난관을 해결해 주었다. 이들 생쥐의 개발 이후에 생쥐의 체내에서 면역반응을 조절하는 단백질 생성을 인위적으로 막거나 혹은 과량으로 생성시키는 방법 등이 적용된 더 발전한 면역 결핍 생쥐들이 개발되었다. 면역반응이 일어나기 위해서는 면역세포 상호간 신호를 주고받는 것이 중요하다. 서로 멀리 떨어진 세포들은 사이토카인(cytokine)과 같은 단백질을 분비하며, 서로 붙어있는 상태에서는 보통 세포 표면 단백질의 접촉을 통해서 신호를 주고받는다. 사이토카인은 주로 면역세포들이 만들어내는 작은 크기의 단백질인데 인터루킨 (interleukin, IL)과 인터페론(interferon, IFN) 등이 대표적이며 종류에 따라 면역반응을 일으킬 수도 있고 억제할 수도 있다. 예를 들면 인터루킨-2 (interleukin-2, IL-2)의 경우 T 세포의 활성화를 일으키지만 인터루킨-10 (interleukin-10, IL-10)은 반대로 작용한다. 면역반응을 조절하는 기능 이외에도 사이토카인은 면역세포의 발생과 성장을 촉진하는 기능도 있다. 인터루킨-7 (interleukin-7, IL-7)의 경우 B 세포나 T 세포 그리고 자연살해세포의 발생 초기에 성장인자(growth factor)로 작용하며 인터루킨-15 (interleukin-15, IL-15)는 자연살해세포의 초기 생존에 중요한 역할을 한다. 이밖에도 과립세포 자극인자(Granulocyte Colony Stimulating Factor, G-CSF), 대식세포 자극인자(M-CSF), 과립-대식세포 자극인자(GM-CSF) 등은 중성구(neutrophil), 단핵구(monocyte), 수지상세포(dendritic cell)를 비롯한 다양한 면역세포의 발생 및 성장을 촉진하는 기능이 있다. 이러한 신호 전달 단백질의 기능을 인위적으로 조절하여 NOD-SCID와 NOD-rag1-/-생쥐에서 더 발전된 면역결핍 생쥐들이 만들어지게 되었다.

1) NOG, NSG, NRG 그리고 DKO 생쥐
  사이토카인과 결합하여 신호를 받아들이는 수용체(receptor)는 보통 세포 표면에서 두 개 이상의 단백질이 모인 형태를 이루고 있는 경우가 많다. 예를 들면 인터루킨-2와 결합하는 수용체(Interleukin-2 receptor, IL-2R)의 경우 알파(IL-2Rα), 베타(IL-2Rβ), 감마(IL-2Rγ) 이렇게 3 가지의 단백질로 구성되어 있다. 흥미롭게도 세 번째 감마(IL-2Rγ) 단백질의 경우 인터루킨-2 뿐만 아니라 인터루킨-4, 7, 9, 15, 21 등 다른 사이토카인들의 수용체에도 공통적으로 필요한 단백질이다. 즉, 인터루킨-2 수용체 감마 (IL-2Rγ) 단백질에 대한 유전자(Il2rg) 하나만 인위적으로 제거하더라도 여러 사이토카인들이 기능을 발휘 하지 못하게 된다. 잘 알려진 예로써 자연살해세포가 생겨나기 위해서는 인터루킨-7과 인터루킨-15에 의한 신호가 중요한데 Il2rg가 제거되면 이 세포는 생성되지 않게 된다. 따라서 NOD-SCID와 NOD-rag1-/-생쥐의 면역성을 더욱 더 감소시키기 위해 Il2rg가 제거된 생쥐(Il2rgnull로 표시함)와 각각 교배시킨 결과로 얻어진 새로운 종류의 면역결핍 생쥐들이 바로 NOG, NSG 그리고 NRG 생쥐이다[6, 7]. 참고로 NOG, NSG, NRG는 일반적으로 사용하는 생쥐의 명칭이며 정식 계통 명칭은 아니다. NOG와 NSG 생쥐의 경우 모두 NOD-SCID 생쥐와 Il2rgnull 생쥐의 교배에 의해 생겨났지만 서로 다른 명칭을 사용하는 이유는 NOD-SCID 생쥐를 제작할 당시 사용된 NOD 생쥐의 종류가 다르기 때문이다. NRG 생쥐는 NOD-rag1-/-생쥐와 Il2rgnull 생쥐간의 교배에 의해 생겨났다. NOD 생쥐를 기반으로 하여 제작된 이들 면역 결핍 생쥐들 이외에도 인간화 생쥐 제작을 위해 사용되는 또 다른 면역 결핍 생쥐가 있다. rag1-/-생쥐와 Il2rgnull 생쥐간의 교배에 의해 생겨난 rag1-/-Il2rgnull 생쥐가 그것이며 두 가지의 유전자가 결핍되어 있어서 인간화 생쥐 제작 분야에서는 일반적으로 이 생쥐를 이중 유전자 결손(double knock-out, DKO) 생쥐 혹은 DKO 생쥐라고 부른다. NOG, NSG, NRG 그리고 DKO 생쥐 모두 우수성이 입증되어 현재 인간화 생쥐 제작에 주로 사용되고 있다(Table 1)[8].

2) 이식 효율성 향상을 위한 유전자 도입
  생쥐의 면역성을 감소시키기 위해 Il2rg와 같은 유전자를 제거하기도 하지만 반대로 이식된 세포들의 생성과 분화에 도움이 되는 유전자를 생쥐 내로 도입(knock-in) 시키기도 한다. 예를 들자면 T 세포의 생성을 촉진하는 인터루킨-7 유전자를 들 수 있다. 비록 교차 반응으로 인해 생쥐의 인터루킨-7 단백질이 인간 T세포에도 작용할 수는 있지만 사람의 인터루킨-7 단백질에 비해서는 그 기능이 떨어질 수밖에 없다. 따라서 인간의 인터루킨-7 유전자가 추가로 도입된 면역 결핍 생쥐에 조혈모세포를 이식한다면 T세포 생성이 한층 더 원활해지게 될 것이다. 인터루킨-7 이외에도 적혈구 생성과 관련된 thrombopoietin 유전자, 대식세포 및 과립세포의 분화를 촉진하는 인터루킨-3/GM-CSF 혹은 M-CSF 유전자가 도입된 면역 결핍 생쥐가 차례로 개발되었으며 현재 연구에 활용되고 있다[9].

인간화 생쥐를 이용한 HIV 감염 연구
  오늘날 인간화 생쥐는 HIV를 비롯한 Epstein-barr virus (EBV), Dengue virus (DENV) 등에 의한 바이러스성 감염질환과 살모넬라(Salmonella enteric serovar Typhi, S. typhi)와 같은 박테리아성 감염질환 연구에도 쓰이고 있으며, 또한 사람의 간 조직이 특수하게 이식되어 있는 인간화 생쥐를 이용하여 C형 및 B형 간염 바이러스(Hepatitis C and B virus, HCV and HBV) 그리고 말라리아 원충 (Plasmodium falciparum protozoa)에 의한 감염질환 연구도 시도되고 있다.

HIV 감염질환 연구에 쓰였던 초기의 인간화 생쥐는 면역 체계가 불완전하였기 때문에 제대로 된 연구결과를 얻기가 힘들었다. 이 후 이들보다 향상된 인간화 생쥐가 개발됨에 따라 JR-CSF, Yu-2, NL4-3, NL4-R3A 등 다양한 종류의 HIV 바이러스주에 대한 연구를 통하여 HIV/AIDS를 극복하기 위한 전략들이 개발되고 있다. 뿐만 아니라 복강, 혈관, 점막 조직 등을 HIV 감염 경로로 선택할 수 있기 때문에 HIV에 대한 면역반응, HIV 자체의 병원성, HIV 잠복감염(latency), HIV 진화(evolution), 새로운 HIV 항바이러스 치료제의 효능 평가, 유전자 치료(gene therapy), 점막조직에서의 HIV 전파 등 다양한 연구 분야에 활용되고 있다(Table 2)[10]. 이 중에서 점막 조직에서의 HIV 전파에 대한 연구에는 주로 NOD/SCID-BLT 혹은 NSG-BLT 생쥐가 많이 이용되고 있는데 그 이유는 다른 인간화 생쥐와 비교 하였을 때 이들의 소화기 점막 조직에 월등히 많은 수의 인간 면역세포들이 존재하기 때문이다. 이는 골수/간/흉선 조직이 이식된 BLT 생쥐의 특성상 점막 조직과 같은 특수한 조직에도 침투할 수 있는 고도로 분화된 면역세포들이 많이 생성되었기 때문일 것으로 생각된다.

최근 연구를 통해 알려진 것 가운데 무엇보다도 흥미로운 것은 그 동안 HIV에 감염된 환자에게서만 관찰되었던 HIV에 대한 항체와 HIV에 특이적인 면역반응이 인간화 생쥐에서도 발견되었다는 것이며 이는 HIV/AIDS 백신 개발이나 치료법 연구에 크게 기여를 하게 될 것으로 보인다. 또한 인간화 생쥐를 이용한 최근 연구에서 HIV의 복제를 억제하는 수지상 세포(plasmacytoid dendritic cell)의 새로운 기능을 발견하는 등 사람을 대상으로 하지 못하는 연구들이 인간화 생쥐를 통하여 활발히 진행되고 있다.

III. 맺음말

  인간화 생쥐는 HIV/AIDS를 극복하기 위한 연구의 중요한 수단으로 빠르게 자리매김하고 있으며 HIV에 대한 숙주의 면역반응이 정확하게 어떻게 일어나는지 등 쉽지 않은 문제들에 대한 해답을 제공하고 있다. 그러므로 인간화 생쥐를 이용한 연구에 대한 기대가 더욱 커질 수밖에 없으며 이는 연구 목적에 더욱 부합되는 새로운 인간화 생쥐 개발의 필요성 증가로 이어지고 있다. 현재 국내에서도 국립보건연구원과 건국대학교와의 공동 협력 하에 HIV 감염질환 연구에 사용될 인간화 생쥐 개발이 진행되고 있으며, 이러한 연구 인프라 구축을 통해 국내 HIV 연구 역량이 한층 더 강화될 수 있는 계기가 마련될 것으로 기대하고 있다. 향후 개발될 차세대(next generation) 인간화 생쥐는 HIV 감염과 관련된 모든 종류의 인간 면역세포들에 대한 분석을 가능케 하여 HIV/AIDS 극복을 위한 새로운 가설을 신속하게 검증할 수 있는 수단이 될 것으로 기대되고 있다. 이미 인간화 생쥐는 그 활용범위가 확대되어 AIDS 이외의 여러 질병으로부터 인간을 보호하기 위한 다양한 연구에 사용되고 있는 추세이다. 그러나 인간화 생쥐를 제작하기 위해서는 사람의 세포나 조직이 필요하다는 현실적 어려움 또한 존재하며 이는 국내에서도 마찬가지이다. 따라서 인간화 생쥐를 이용한 연구가 활성화 될 수 있도록 모두가 공감하는 합리적인 방안을 찾는 노력과 지혜가 필요할 것으로 생각된다.

IV. 참고문헌

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