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바이오나노공학을 이용한 고감도 야토균 검출 기술
  • 작성일2015-06-18
  • 최종수정일2015-06-18
  • 담당부서병원체방어연구과
  • 연락처043-719-7166
바이오나노공학을 이용한 고감도 야토균 검출 기술
Bio-nanoengineering for Highly Sensitive Detection of Francisella tularensis


질병관리본부 국립보건연구원 병원체방어연구과
전준호, 이기은
한양대학교 생명나노공학과 나노메디신연구실
김지은, 최종훈
Abstract


Francisella tularensis is a human zoonotic pathogen and the causative agent of tularemia, a severely infectious disease. Given the extreme infectivity of F. tularensis and its potential to be used as a biological warfare agent, a fast and sensitive detection method is highly desirable. The construction of a novel detection platform is composed of two elements: 1) Magnetic beads conjugated with multiple capturing antibodies against F. tularensis for its simple and rapid separation, and 2) Genetically-engineered apoferritin protein constructs conjugated with multiple quantum dots and a detection antibody against F. tularensis for the amplification of signal. The technique is based on a quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCMD), which uses sensor chips modified by a specific antibody. This method demonstrated a fast immunological detection system for the entire F. tularensis pathogen. The use of novel nanoprobe detection platform was envisioned in future applications that require highly-sensitive on-site detection of high-risk pathogens.



Ⅰ. 들어가는 말


  야토균(Francisella tularensis, Figure 1)은 인수공통감염질환인 야토병(tularemia)을 유발하는 비운동성이며, 포자를 형성하지 않는 그람 음성 간구균이다[1-2]. 야토균은 설치류, 유대류, 육식동물, 조류, 양서류, 어류 등 다양한 야생생물에 기생한다[3]. 야토균은 tularensis 아종, holarctica 아종, mediasiatica 아종과 novicida 아종의 4가지로 분류되며, 이중 tularensis 아종은 치사율이 매우 높은 type A로, 감염 시 상대적으로 병증의 정도가 약한 holarctica 아종은 type B로 분류되고 있다[4-5]. 야토균은 진드기(tick) 등의 절지동물에 물리거나, 감염된 동물과의 접촉, 감염된 물이나 음식의 섭취, 오염된 공기 흡입을 통해 사람에게 전파될 수 있다[6]. 야토균은 생체 내에 감염되었을 때 대식세포와 같은 면역세포의 식세포작용(phagocytosis)에 의하여 phagosome 내부에 갇히게 되지만 완전히 사멸되지 못하고 증식되어 세포를 터트리고 나와 주변의 다른 세포를 감염시키는 것으로 알려져 있다(Figure 2). 야토균에 감염되면 보통 2-10일 정도의 잠복기를 가지며, 오한, 발현, 두통과 같은 감기와 유사한 증상을 나타내며 적절한 치료를 받지 못할 경우 사망에 이를 수 있다[4]. 야토병은 주로 북반구에서 발생사례가 보고되고 있으며, 북아메리카, 유럽 그리고 북부 아시아 등지에서 광범위하게 발생되고 있다. 우리나라에서는 1996년 포항에서 죽은 야생 토끼를 상처가 있는 손으로 요리하여 감염된 사례가 보고된 바 있다[7].

야토균은 높은 감염력 및 치사율로 인하여 냉전시기인 1960년대에 미국에서 생물무기로 개발된적이 있으며, 세계보건기구에서는 1969년에 500만 명이 거주하는 대도시에 야토균 50kg을 공기중에 에어로졸의 형태로 살포할 경우 250,000명이 감염될 수 있으며, 그 중 19,000명이 사망할 것으로 예측하였다. 이와 같은 야토균의 위험성으로 인하여 미국 질병관리본부에서는 야토균을 Tier 1 select agents and toxins으로 지정하여 관리하고 있다[4, 8].

Ⅱ. 몸 말


전통적인 야토균의 진단방법
  야토균 진단을 위해서 배양, 혈청학적 진단법, 16S rDNA 시퀀싱 등의 전통적인 방법들이 사용되어 왔으며, 민감도와 특이도를 높이기 위해 분자생물학적 기법과 면역학적 기법을 이용한 검출방법도 이용되고 있다. 분자생물학적 기법으로는 야토균 특이 유전자를 이용한 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR, Figure 3)이 이용되어 왔는데, 이 검출법은 높은 특이성을 나타내며 배양법보다 비교적 빠른 진단이 가능하다는 장점이 있다[10]. 최근 진단의 정확성을 높이고 좀 더 빠른 진단을 위해 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time PCR)이나 다중 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 이용한 검출법도 널리 이용되고 있다. 하지만 PCR을 통한 검출기법은 박테리아의 DNA를 추출해야 하는 전처리 과정이 필요하므로 시간이 다소 오래 걸리는 단점이 있다. 면역학적 기법으로는 야토균 리포다당(Lipipolysaccharide, LPS)에 대한 면역반응을 기반으로 하는 효소 면역 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA, Figure 4)이 있으며, 이 방법을 이용하면 103-104CFU/mL 정도의 검출한계까지 야토균을 검출할 수 있다[12]. PCR과 ELISA 방법은 비교적 높은 민감도를 나타내지만, 복잡한 실험과정과 오랜 측정시간이 필요하다는 단점이 있다[4]. 야토균의 검출을 위한 면역크로마토그래픽기법은 테스트 스트립에 샘플 용액을 몇 방울 떨어뜨려 test line의 색깔 변화를 확인하는 방식으로 쉽고 빠르게 병원균의 양을 측정할 수 있다[13]. 하지만 이러한 스트립의 경우 독소는 1-50ng/mL의 범위까지 검출 할 수 있는 반면에 박테리아의 경우에는 105-106CFU/mL 정도의 낮은 민감도를 가지는 단점이 있다[14]. 따라서 적은 수의 병원균을 탐지하기 위해서는 추가적인 배양이 필요하다. 이와 더불어, 금 콜로이드 나노입자들과 결합하였을 때 나타나는 색 변화를 육안으로 확인하기 때문에 편향된 오류가 발생할 수 있다는 단점이 있다[15]. 최근에, 이러한 문제들을 해결하기 위해 바이오나노공학 기술을 이용하여 고위험성 병원균을 정확하고 신속하게 검출하는 동시에 현장에서 이를 쉽게 이용할 수 있는 새로운 개념의 진단기술들이 개발되고 있다.

바이오나노공학을 통한 검출기법
  검출시간을 단축하고 정확성을 높이기 위해 나노공학을 접목한 검출방법들이 많이 개발되고 있으며, 실제 검출에도 많이 사용되고 있다. 이러한 검출방법들은 유전공학과 화학을 이용하여 개발된 나노물질들을 주로 사용하고 있으며, 이 물질을 이용하면 검출의 민감도와 정확성을 획기적으로 증진시킬 수
있다. 특히, 최근에는 시료를 전 처리하지 않고 병원균체의 리포다당에 특이적으로 결합하는 항체를 고정한 나노입자들을 이용한 분석 방법들이 많이 개발되고 있다. 예를 들어, 낮은 광학적 안정성과 민감도를 가지는 형광염료와 비교하여 양자점(Quantum Dot, QD)은 높은 양자 수율을 가지며, 크기와 구성 물질을 조절하여 형광 방출 파장을 변화시킬 수 있는 장점을 가지고 있다. 이러한 양자점은 인체에 독성을 가지지만 병원균 검출과 같은 체외진단에 사용하는 것은 크게 문제가 되지 않는다. 또한, 자성입자를 같이 이용하면 시료에서 병원균을 쉽게 분리 할 수 있는데, 이러한 자성입자는 지지체로 양자점은 바이오센싱을 위한 라벨링 물질로 이용될 수 있다[16]. 최근에는 인체적용을 위한 생체 친화적인 나노물질들도 많이 연구되고 있다. 한 예를 소개하면, 유전자 재조합 기술과 대장균을 이용한 단백질 발현시스템을 통해 직경 10-15nm의 균일한 크기를 가지는 아포페리틴(Apoferritin, AFTN)을 제조할 수 있는데, 이 나노물질은 24개의 서브유닛으로 구성되어 있고, 각각은 6X His tag와 protein G를 발현시킬 수 있게 유전적으로 재조합 되었다[17](Figure 5).

6X His tag는 Ni-NTA로 기능화 된 나노입자와 결합할 수 있으며, protein G는 병원체 특이적 항체인 Fc 부분에 결합할 수 있기 때문에 특이적 결합이 가능하다. 이러한 기능성 나노입자를 검출 프로브로, 특이적 항체가 고정화된 자성입자를 지지체로 각각 사용하여 야토균을 검출하면 측정 민감도를 획기적으로 증진시킬 수 있다. 이와 같이 단백질 나노구조체 기반의 검출기법을 이용하면 기존 ELISA 기반의 병원체 검출방법이 가지고 있는 특이성과 정확성의 한계를 극복할 수 있다. 다음 그림은 샌드위치 면역분석 방법과 야토균에 특이적인 항체가 결합된 금나노입자 및 quartz crystal microbalance (QCM) sensor chip을 이용한 야토균의 검출방법을 소개하고 있는데, 이 방법을 이용하면 15-20분 정도의 짧은시간 내에 4 × 103 CFU/mL 정도의 최저 검출 한계로 야토균을 검출하는 것이 가능하다(Figure 6).

Ⅲ. 맺음말


  야토균은 10개 정도의 균 감염으로도 사람을 사망에 이르게 할 수 있는 무서운 병원체로, 생물테러에 사용될 수 있는 가능성이 높은 병원체이다. 따라서 야토균을 이용한 생물테러 발발 시 신속하고 정확하게 이를 감지할 수 있는 새로운 검출방법의 개발이 절실히 필요한 실정이다. 본 기고에서는 기존의 검출기법에 다양한 나노기술을 접목하여 검출의 정확성과 특이성을 획기적으로 증진시킬 수 있는 새로운 나노센서 기반의 야토균 검출방법에 대하여 소개하였으며, 향후 추가적인 개발을 통하여 이와 같은 실험 기법들이 생물테러 발생 현장에서 직접 이용될 수 있을 것으로 기대한다.

Ⅳ. 참고자료

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