Abstract


The 14-3-3 protein has been used as a biomarker for the diagnosis of sporadic Creutzfeldt-Jakob Disease (sCJD). There are three criteria for its diagnosis: positive, weakly positive, and negative. In a few incidents, weakly positive for 14-3-3 protein led to false positive results and an incorrect diagnosis. Thus, in order to provide an accurate diagnosis, we attempted to compare the quantitative data between 14-3-3 protein and tau protein, which was well-known and important biomarker in neurodegerative diseases. Sixty-two patients with sCJD, including pathologically confirmed, clinically definite, and probable cases, and 89 non-CJD patients were investigated. Among them, 20 sCJD and 14 non-CJD showed weakly positive results for 14-3-3 protein. The levels of total tau (t-tau) and phosphorylated tau (p-tau) proteins were measured by ELISA, and the p-tau to t-tau ratio (p/t ratio) was calculated. The combined use of the 14-3-3 protein assay, t-tau levels, and p/t ratio improved the specificity of diagnosis in comparison with 14-3-3 protein assay alone. In addition, 18 out of 20 sCJD and 12 out of 14 non-CJD cases, which were weakly positive for 14-3-3, were positive and negative for the p/t ratio, respectively. Therefore, the use of combined assay of 14-3-3 protein and tau proteins could be considered as biomarkers for the precise diagnosis of sCJD.


Ⅰ. 들어가는 말


  프리온 질병은 치명적인 퇴행성뇌질환 중 하나로 뇌에서 프리온 단백질의 비정상적인 접힘과 축적에 의해 발병하며, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jacob Disease, CJD)은 사람에서 나타나는 프리온 질환 중 하나이다. CJD는 95% 이상이 산발적 CJD (sporadic CJD, sCJD)이며 World Health Organization (WHO) 가이드라인에서 sCJD에 대한 실험실 진단 기준으로 뇌척수액 내 14-3-3 단백질 검출(정상인 대비 증가) 항목이 포함되어 있다[1, 2].

하지만 14-3-3 단백질 검출법은 몇 가지 보완해야 할 부분이 있다. 각 나라마다 항체의 선정, 관련 장비 및 시약 등 다소 상이한 SOP (Standard Operating Procedure)를 적용하고 있다[3]. 또한 평균적으로 민감도는 90%에 가깝게 산출되지만 특이도는 43%에서 97%까지 다양하게 보고되고 있고 정성적 또는 반정량적 실험 방법이기 때문에 실험자의 주관적인 판단으로 인한 오류와 실험실마다 대조군 기준에 차이가 있을 수 있다.
이러한 보완점을 해결하기 위해 원인 병원체 증폭 후 직접 검출하는 실험법의 개선과 다른 바이오마커 발굴에 대한 연구가 광범위하게 진행 중이다. 그 중 tau 단백질은 알츠하이머병 등 치매 관련 질병에서 사용되는 바이오마커로써 알려져 있지만 CJD 환자에서도 특이적으로 발현되는 특징을 갖는다고 보고되어 왔다[5]. 따라서 본 연구에서는 sCJD 의심환자에서 tau 단백질의 두 가지 타입(total tau, t-tau; phospho-tau, p-tau)과 p-tau/t-tau ratio (p/t ratio)를 측정하고 14-3-3 결과와 비교, 분석하여 CJD 실험실 진단에 유용한 마커로써 사용될 수 있다고 판단하여 그 결과를 소개하고자 한다.

Ⅱ. 몸 말


  CJD 진단 기준을 충족하는 62명의 환자군과 CJD가 아닌 89명의 대조군을 선택하여 뇌척수액에서 각각의 바이오마커를 측정하였다. 14-3-3 단백질은 환자군 62명 중 61명에서 양성이었고 대조군 89명 중 45명에서 음성이었다. 이것은 민감도는 높지만 특이도는 낮다는 것을 의미한다. Tau 단백질을 살펴보면 t-tau는 환자군에서 33건이 양성이고 대조군에서 80건이 음성이었다. 민감도는 떨어지지만 특이도가 상당히 높은 것을 알 수 있다. p/t ratio는 환자군에서 42건이 양성, 대조군에서 65건이 음성이었다. 요약하면 14-3-3은 민감도가 높은 반면 특이도가 낮으며 t-tau는 민감도는 낮지만 특이도는 높게 나타났다. 또한 p/t ratio는 민감도 및 특이도가 평균의 수준을 나타냈다. p-tau의 경우는 두 군에서 유의적인 차이점을 나타내지 못했다. 자세한 결과는 Figure 1과 Table 1과 같다.

이러한 측정값을 토대로 민감도 및 특이도 등 통계적 데이터를 구하기 위해 Receiver operating characteristic (ROC) curves를 구하였다. 민감도(sensitivity, Se)와 특이도(specificity, Sp)는 Youden Index J (Se+Sp-1)를 적용하여 최적의 값을 산출했다. Tau 단백질 분석과 14-3-3 단백질 검사결과를 적용하여 양성과 음성을 재분류한 결과, Area under the ROC curve (AUC)의 면적이 p-tau에서는 a와 b가 차이가 없는 것을 알 수 있었다(Figure 2). 반면에 t-tau와 p/t ratio는 AUC의 면적이 14-3-3을 추가로 적용한 b에서 더 증가한 것을 알 수 있었다. AUC 면적이 증가한 만큼 정확도가 더 증가된 것을 의미한다. Table 2와 3을 보면 좀 더 자세한 데이터들이 통계적 근거에 의해서 산출되었다. Tau와 14-3-3 단백질을 조합하여 적용한 결과 t-tau와 p/t ratio를 14-3-3과 함께 적용하였을 때 민감도 및 특이도가 크게 향상되는 것을 알 수 있었으며 특히 p/t ratio를 적용한 것의 정확도가 더 증가하였다.

Weak 14-3-3 positive 판정 가운데 false positive의 오류를 일으킬 수 있는 경우가 있어 특이도 향상에 대한 검토가 있어 왔다. 몇 개월 후 환자 검체를 다시 채취하여 확인해 보면 좀 더 정확히 알 수 있는 경우도 있지만 이것은 현실적으로 어렵다. 따라서 weak 14-3-3 positive로 판정된 의심환자 CSF를 대상으로 위에 기술했던 방법과 동일한 cut-off를 적용하여 재분류해 보았다. 총 34건의 weak 14-3-3 positive 검체를 선정 후 두 군으로 나누고 각각의 tau 값들을 나열하여 양성 또는 음성으로 판정하였다. 그 결과, p/t ratio 판정 결과가 환자군에서 대부분 양성이었으며(18/20) 대조군에서 대부분 음성이었다 (12/14) (Table 4). p/t raio는 CJD 환자를 구별하는 데 중요한 지표근거가 될 수 있다는 것을 확인하였다

Ⅲ. 맺는말


  CJD 의심환자 판정은 임상의에 의한 환자의 임상 증상 및 뇌영상 측정 소견과 실험실에서의 생화학적 검사결과를 종합하여 CJD 특이적인 특징을 나타내는지 결정한다. 질병관리본부 국립보건연구원 인수공통감염과에서는 2005년부터 현재까지 CJD 실험실 진단을 수행하고 있으며 진단업무 효율화를 위한 진단법 개선 및 새로운 진단법 개발을 목표로 업무를 수행하고 있다. 14-3-3 단백질은 중추신경계에 이상이 생길 경우 뇌척수액으로 과량 분비되어 의심환자의 뇌척수액에서 증가된 양을 간단하게 측정할 수 있다. 하지만 반드시 CJD가 아니더라도 다른 중추신경 이상반응에서도 14-3-3의 양이 증가되기 때문에 14-3-3 단백질 검출 진단법의 특이도 지적은 계속되어 왔다. 특히, 국내에서는 CJD 확진판정에서 요구되는 조직 부검 검사가 어렵기 때문에 체액을 이용한 감별 진단법 개발이 꾸준히 요구되어 왔다. Tau 단백질은 그 자체만으로는 CJD 특이적이지 않으며 알츠하이머병에서 주로 사용되는 바이오마커이지만 total tau와 phosphorylated tau를 각각 측정하여 이 둘의 상대적인 비율을 계산한 값(p/t ratio)은 CJD 특이적인 패턴을 보이고 있다[6]. 따라서 14-3-3 단백질과 tau 단백질의 검출을 동시에 수행하여 실험실 진단 결과로 적용한다면 CJD 의심환자의 판정에 좀 더 신뢰할 만한 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

Ⅳ. 참고문헌


1. Zerr, I. et al. 2009. Updated clinical diagnostic criteria for sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Brain 132, 2659-68.
2. 크로이츠펠트-야콥병 및 변종 크로이츠펠트-야콥병 관리지침. 2012. 질병관리본부.
3. Gmitterova, K. et al. 2009. 14-3-3 CSF levels in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease differ across molecular subtypes. Neurobiol Aging 30, 1842-50.
4. Geschwind, M.D. et al. 2003. Challenging the clinical utility of the 14-3-3 protein for the diagnosis of sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Arch Neurol 60, 813-6.
5. Hamlin, C. et al. 2012. A comparison of tau and 14-3-3 protein in the diagnosis of Creutzfeldt-Jakob disease. Neurology 79, 547-52.
6. Satoh, K et al. 2006. 14-3-3 protein, total tau and phosphorylated tau in cerebrospinal fluid of patients with Creutzfeldt-Jakob disease and neurodegenerative disease in Japan Cel lMol Neurobiol 26, 45-52.