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표준 검사법을 이용한 국가 진단의학 표준검사실 내 총 콜레스테롤의 정량검사
  • 작성일2015-07-30
  • 최종수정일2015-07-30
  • 담당부서만성질환관리과
  • 연락처043-719-7166
표준 검사법을 이용한 국가 진단의학 표준검사실 내 총 콜레스테롤의 정량검사
Quantification of Total Cholesterol by Reference Measurement Method
in National Medical Reference Laboratory

질병관리본부 질병예방센터 만성질환관리과
이경섭, 이동한
Abstract

Accurate and precise total cholesterol measurements are needed to improve diagnosis and treat arteriosclerosis and hyperlipidemia. The Abell-Kendall method, which is a conventional procedure that measures cholesterol in the human blood serum, has been reported to be imprecise and has shown positive bias caused by fastidious manual operation and inaccurate instruments. To overcome this problem, the Korea Centers for Disease Control and Prevention (KCDC) established the Reference Measurement Procedure (RMP) for total cholesterol, which designates target values to the serum materials for verification and calibration. This RMP for total cholesterol can serve as a higher-order standard for measurement traceability and can be used to conduct accurate proficiency tests. The National Medical Reference Laboratory at the KCDC applies this RMP in value assignment services for clinical laboratories, manufacturers, and research institutes. In this paper, the ongoing RMP for measuring total cholesterol at the National Medical Reference Laboratory was described.



I. 들어가는 말

  콜레스테롤은 흰색의 결정성 물질로 분자량은 386.6g/mole, 분자식은 이고 냄새와 맛이 없으며 물에도 거의 녹지 않는다(Figure 1). 유리형과 에스테르형 두 가지 형태로 존재하는데 유리형은 몸의 구성요소로서 세포의 표면과 신경조직에 많이 분포하며 에스테르형은 콜레스테롤에 지방산이 결합된 것으로 혈액과 간에 많이 존재한다.

세포막을 구성하는 구성요소로서 콜레스테롤은 세포 내로 이물질이 들어오지 못하도록 하고, 세포의 물질 교환과 신호전달이 원활하게 일어날 수 있도록 하며, 세포막의 강도 역시 콜레스테롤의 양에 의해 결정된다. 체내에서 정상적으로 대사분해가 되면 주로 담즙산이나 성호르몬, 부신피질호르몬 등 생리 활성 물질로 전환되기도 한다. 이러한 중요 역할을 담당하는 물질이지만 혈액 내 농도가 높아졌을 때에는 문제가 발생하게 된다. 건강검진 기준에 따르면 혈중 총 콜레스테롤의 농도가 230mg/dL를 초과할 때 고농도라고 판정하며[1] 이와 같은 기준 농도 이상으로 혈관 내 지방질이 많아졌을 시에는 혈액의 흐름이 원활하지 못하여 관상동맥질환과 뇌경색과 같은 죽상경화성 혈관질환이 발생할 위험이 커진다. 따라서 동맥경화성 질환의 예방과 치료의 중요성이 높아질수록 더 정확하고 정밀한 콜레스테롤 농도 측정이 필요하다. 정확성과 정밀함이 향상된 측정방법은 추가검진 횟수 또한 줄임으로써 보건의료비용 감소에 큰 역할을 할 수 있다.

현재 전 세계적으로 사용하고 있는 총 콜레스테롤 표준 검사법은 Abell-Kendall 검사법과 동위원소희석 기체크로마토그래피/질량분석 검사법이 있으며, 임상검사실에서는 전통적으로 사용해 온 Abell-Kendall 검사법에 측정소급성을 갖는 측정법을 더 많이 사용하고 있다. 하지만 Abell-Kendall 검사법은 검체의 매질과 그 안의 간섭물질의 영향을 받아 검사의 정확도와 정밀도가 떨어지는 단점을 가지고 있었는데, 이를 보완하기 위해 고안된 검사방법이 동위원소희석 기체크로마토그래피/질량분석 검사법이다(Table 1).

국가 진단의학 표준 검사실에서는 혈중 총 콜레스테롤을 최대한 정확하게 측정하여 그 참값을 찾는데 목적을 두고, JCTLM (Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine, 측정소급성 인정을 위한 임상검사실 간 협의체)에 등재되어 국제적으로 유효성을 입증한 동위원소희석 기체크로마토그래피/질량분석 표준 검사법을 사용하였다. 더불어 검사의 유효성 확립을 위하여 인증표준물질인 NIST (National Institute of Standards and Technology) SRM (Standard Reference Material) 1951c를 정도관리물질로 사용하면서 검사를 실시하였다. 또한 CRMLN (Cholesterol Reference Method Laboratory Network, 지질 표준 검사실 네트워크)에 2013년 7월부터 회원검사실로 가입하여 현재까지 유지하고 있으며, 국외 정도관리에 매년 참여하여 양질의 검사를 수행하고 있다. CRMLN은 미국 CDC (Centers for Disease Control and Prevention)를 중심으로 전 세계 지질 표준 검사실들이 모인 네트워크로서, 이들 검사실들을 통하여 지질항목의 참값부여와 시약 제조사들에 대한 인증부여를 실시하여 지질검사의 표준화를 이끌고 있다. 또한 미국 CDC는 임상검사실을 대상으로 지질 표준화 프로그램을 시행함으로써 각 검사실의 지질 항목의 측정이 CDC의 표준 검사법과 측정소급성을 가지는지를 평가해주고 있다. 국내 임상검사실이 CRMLN 인증을 받은 시약과 칼리브레이터 조합을 사용하고, 정확도 기반 외부정도관리 참여를 통해 정확성 평가 및 표준화를 도모한다면 콜레스테롤 검사의 신뢰도가 크게 향상될 것으로 기대한다. 이 글에서 CRMLN회원인 국가 진단의학 표준 검사실이 현재 수행중인 총 콜레스테롤 검사방법에 대해 소개하고자 한다.

II. 몸 말


 1. 실험방법
  1) 시약
  무수 에탄올(ACS, 200 proof), 수산화칼륨(ACS, ≥85%), 헥산(ACS, ≥99%), 트리톤X-100(Molecular biology), Tris-HCl(Reagent grade, ≥99%)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)제품을 사용한다. 증류수는 Millipore Direct Q-8 system과 0.22 μm PVDF membrane filter(Millipore, Bedford, MA, USA)를 사용하여 얻는다. 일차표준용액 제조에 쓰인 콜레스테롤 고순도 표준물질(NIST SRM 911c)과 분석방법의 유효성을 확인하기 위하여 사용된 혈청표준물질(NIST SRM 1951c)은 NIST(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입한다. 동위원소표지 내부표준물질, 콜레스테롤-3,4-(99%)는 Cambridge Isotope Laboratories, Inc.(Andover, MA, USA)에서 구입하여 사용한다.

  2) 표준용액 준비
  콜레스테롤 고순도 표준물질 1g을 에탄올에 녹여 10mg/g 농도가 되도록 1차 표준용액을 만들고 1차 표준용액을 다시 에탄올로 희석하여 25-400μg/g 사이 농도로 7개의 칼리브레이션 표준용액을 제조한다. 동위원소표지 콜레스테롤 표준용액은 콜레스테롤-3,4-(99%) 100mg을 에탄올에 녹여 0.5mg/g가 되도록 만든다.

  3) 콜레스테롤 분석 전처리
  -70 ℃에서 보관중인 혈청시료들과 4℃에 보관중인 칼리브레이션 표준용액, 동위원소표지 콜레스테롤 표준용액을 혈액혼합기로 15분 이상 잘 섞는다. 혈청시료들은 다시 Tris-HCl용액으로 20배 희석하여 혈액혼합기로 30분 이상 돌려 섞는다. 동위원소표지 콜레스테롤 표준용액, 혈청 희석액을 1:1 비율로 0.33 M 에탄올/수산화칼륨과 함께 분주한다. 50℃에서 한 시간 동안 가열한다. 헥산과 증류수를 넣고 진탕기에서 15분 이상 섞어준 다음 상층액을 분리하여 질소농축기로 건조시킨다. Tri-sil-BSA 시약을 첨가한 후 70℃에서 90분간 유도체화 한다.

  4) 기체크로마토그래피/질량분석
  기체크로마토그래피는 Agilent 7890GC를 사용하고, 질량분석기는 Agilent 5975C MSD 모델을 사용한다. 분석칼럼은 DB5-MS (J&W, Torrance, CA)을 사용한다. 시료도입부의 온도를 295℃로 설정하고 유속은 1.0mL/min, 시료는 1μL을 주입한다. 질량분석기에서는 선택이온분석법(Selected Ion Monitoring, SIM)으로 이온원 온도는 250℃, 사중극자 질량분석관 온도는 150℃로 설정하고 전자증배관의 전압은 70 eV를 유지한다. 초기 오븐온도는 250℃로 약 1분간 유지된 후 분당 30℃ 속도로 최종 300℃까지 올라가서 약 3분간 유지되는 조건으로 시료를 용출시킨다. 콜레스테롤은 m/z 368.5, 콜레스테롤-3,4-는 m/z 370.4에서 확인한다.

  5) 결과산출
  콜레스테롤과 콜레스테롤-3,4-의 질량분석 스펙트럼을 확인한 후 각각의 질량 크로마토그램의 면적을 구한다. Siekmann의 방법에 따라 선형보정하고, 질량분석한 모든 검체들에 대해서 콜레스테롤과 콜레스테롤-3,4-의 면적비를 구한다. 칼리브레이션 표준용액 측정결과로 보정곡선을 그린 다음, 혈청시료 측정결과를 보정곡선에 대하여 회귀분석하여 농도를 산출한다.


  2. 표준 검사법의 유효성 확인
  1) 표준 검사법의 선택성

   검사 시행 중 pH 변화에 의한 영향을 살펴보기 위해 혈청 시료의 희석 시 1% Formic acid 50μL를 혼합하여 검사하였다. 정상 검체인 LRC3 (Lipid Reference Control3)와 방해 물질 1% Formic acid 50μL가 첨가된 검체인 F50_LRC3를 각각 7회 반복하여 얻은 결과의 평균값이 231.3과 231.4로 동일한 결과값을 나타내었다. 또한 변동계수 값도 정도관리로 사용한 Liquicheck 1,2 검체와 LRC3, F50_LRC3 검체 모두 1% 미만으로 실험의 정밀도도 우수하였다. 이것으로 볼 때 방해물질인 1% Formic acid에 대해 영향을 받지 않는 실험임을 확인하였다(Table 2).

  2) 표준 검사법의 직선성
  직선성에 대한 평가는 총 7개 농도의 칼리브레이션 표준용액의 결과 값으로 평가하였다. 공시험시료를 포함한 8개 칼리브레이션 표준용액에 대해 2회 반복 실험하여 상관계수의 변동분석을 실시하였다. 상관계수가 0.999 이상 1.0 이하면 적합하다고 판단한다. 또한 칼리브레이션 표준용액의 결과 값들이 그동안 산출하였던 결과 값들의 ±1SD를 한계로 하여 이를 벗어났을 시 Lower, Higher 라고 판단하고 이러한 결과 값은 교정곡선을 산출하는 데 있어서 제외시킨다. 상관계수 값이 0.99994로 산출되었으므로 표준검사법이 직선성을 가지고 있음을 확인하였다(Figure 2).

  3) 표준 검사법의 정확성
   미국 CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)에서 출판된 지침서 37-A (Preparation and Validation of Commutable Frozen Human Serum Pools as Secondary Reference Materials for Cholesterol Measurement Procedures; Approved Guideline) 에 따라 분당 서울대병원에서 제조한 CFS 12_2_1∼3 검체를 정확성 시험에 사용하였다. CFS 12_2_1∼3 검체의 참고 값은 미국 CDC 내 CRMLN 실험실에 의뢰하여 확보한 후 정확성 실험 결과와 비교하여 회수율을 산정하였다. 서로 다른 3가지 농도에서 7회 반복 측정한 결과 회수율이 모두 평균 99% 이상으로, 참고 값과의 차이가 1% 미만으로 산출되었다. 또한 인증표준물질인 NIST SRM 1951c로 실험한 결과 두 가지 농도에 대해서 인증 값과 실험 값 사이의 오차가 1% 미만으로 산출되었다. 이로써 표준 검사법의 정확성을 확인하였다(Table 3).

  4) 표준 검사법의 정밀성과 재현성
  균질성이 확보된 CFS 12_2_1∼3 검체를 사용하여 당일 7회 반복 실험한 결과와 검사 일자가 다른 6일간 재현성 시험한 결과의 변동 계수 값이 모두 1% 미만으로 산출되었으므로 표준 검사법이 정밀성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(Table 4, 5).

III. 맺는 말


  CRMLN 및 많은 임상검사실에서 그간 적용해 온 Abell-Kendall 방법은 국가 진단의학 표준 검사실에서 사용하는 동위원소희석 기체크로마토그래피/질량분석 표준 검사법에 비해 비특이적인 반응으로 인해 약 1.6% 정도의 양성오차가 발생하므로, 미국 CDC에서는 동위원소희석 기체크로마토그래피/질량분석 표준 검사법을 권장한다[2, 3]. 하지만 대부분의 국제적 역학연구에서 Abell-Kendall 방법을 적용하여 나온 결과를 바탕으로 연구를 수행하였고, 실제로 검사를 시행하는 병원과 검사센터의 진단의학 검사실에서는 아직까지 Abell-Kendall 방법에 측정소급성을 갖는 측정법을 사용하는 곳이 많다. 따라서 국내 검사실의 정확도 평가 및 표준화 사업에 활용되기 위해서는 동위원소희석 기체크로마토그래피/질량분석 표준 검사법에서 측정한 값을 Abell-Kendall 값으로 환산과정이 필요하다. 이를 위해서는 다량의 누적 결과가 필요하나 비교 분석을 실시하기엔 턱없이 부족할 뿐더러 동위원소희석 기체크로마토그래피/질량분석법을 수행할 수 있는 검사실마저도 희소하여 환산식 마련이 어려운 상황이다.
이에 질병관리본부 국가 진단의학 표준 검사실에서는 Abell-Kendall 검사법 역시 도입하여 CRMLN 인증을 받아 동위원소희석 기체크로마토그래피/질량분석법을 동시에 실시하여 두 방법 간 상호교환 적용이 가능한 환산식을 산출하는 방안을 고려하고 있다. 이와 같은 노력이 지속된다면 향후 누적된 검사결과를 바탕으로 환산식을 마련하여 국내 임상검사실에 참값을 적용할 수 있을 것이라 기대한다.

최근, 정확한 콜레스테롤의 검사결과는 최종적으로 사망률 감소로 이어져, 표준 검사실의 표준화 프로그램 도입으로 막대한 의료비용 감소 효과가 있었다는 보고가 있다[4]. 이러한 성과로 비추어 볼 때 국가 진단의학 표준 검사실에서 동위원소희석 기체크로마토그래피/질량분석 표준 검사법을 기준으로 국내 병원 및 검사센터에서 측정되는 콜레스테롤 값의 표준화를 도모한다면 정확한 검사결과를 바탕으로 질병 진단과 조기 치료에 크게 기여할 것으로 생각한다. 콜레스테롤 외 다른 검사항목에 대해서도 국가 진단의학검사 표준화 체계 구축 사업을 통하여 국내 검사실 결과들을 표준화시킨다면 검사실에 대한 국민의 신뢰도 향상과 더불어 재검사율 감소로 의료비용 절감 효과도 크게 향상될 것으로 기대된다.

Ⅵ. 참고문헌


1. 보건복지부, 2014. 2014년 건강검진사업안내, 2014.
2. Edwards SH, Kimberly MM, Pyatt SD, Stribling SL, Dobbin KD, Myers GL. 2011. Proposed serum cholesterol reference measurement procedure by gas chromatography-isotope dilution mass spectrometry. Clin Chem. 51:614-622.
3. P.Ellerbe, G.L.Myers, G.R.Cooper, H.S.Hertz, L.T.Snlegoski, M.J.Welch, E.White. 1990. A Comparison of Results for Cholesterol in Human Serum Obtained by the Reference Method and by the Definitive Method of the National Reference System for Cholesterol. Clin Chem. 36(2):370-375.
4. Hoerger TJ, Wittenborn JS, Young W. 2011. A cost-benefit analysis of lipid standardization in the United States. Prev Chronic Dis. 8:A136.
5. CDC, 2010. ID-GC/MS Reference Measurement Procedure for cholestetrol,
6. Hyesun Shin, Hwashim Lee, Gaeho Lee, 2008. Quantification of cholesterol in human serum by isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry. Anal. sci. & tech.. 21(6):502-509.
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