Abstract


Background: Bacillus cereus is the causative agent of two distinct forms of gastroenteritis: emesis and diarrhea. Multiple Locus Sequence Typing (MLST) is a useful and powerful tool for molecular epidemiology. In this study, different groups of B.cereus isolated from food and patients were investigated to identify the genetic variations through MLST.
Method: MLST was performed on 57 samples of B.cereusandfourB.thuringiensisstrains isolated from food (10 isolates) and diarrheal stools (47 isolates) of patients. Also, presence of five enterotoxin genes (hblC, nheA, entFM ,cytk2 and bceT) and one emetic toxin gene (CER) were analyzed by PCR.
Results: MLST analyses of the 61 isolates generated 34 different STs (sequence types) and among the 34 STs, 12 were newly-registered. MLST gene fragments varied in length from 372 to 504 bps, with average pdistancesof0.012(tpi gene fragment) to 0.081 (ilvD gene fragment). ST 24 (9 isolates) and ST 26 (6 isolates) were dominant in this study. A minimum spanning tree constructed from STs revealed three major phylogenetic groups. The detection rate of hblC, nheA, entFM, cytk2, bceT and CER genes amongst in tested strains were 65.6%, 100%, 96.7%, 67.0%, 41.0% and 10.5%, respectively. Interestingly, the CER gene detected only in ST-26 and hblC gene was absent in ST group II (16 isolates). MLST analysis revealed that the tested strains can be divided into three groups. Toxin gene distribution proved to be highly diverse.
Conclusion: Based on the results of this study, B.cereus was highly heterogeneous with a diverse genetic background; thus, B.cereus could be an important emerging public health threat.



Ⅰ. 들어가는 말


  Bacillus group 속에는 B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. toyonensis, 그리고 B. weihenstenstephanensis와 같이 7개의 종이 포함되며 이중 사람에게 식중독을 유발하는 주요 종은 B. cereus이다. B. cereus에 의한 식중독은 이 균이 생산하는 독소에 의해 발생되는데, 이러한 독소는 설사형(diarrheal type)과 구토형(emetic type)으로 구분된다. 설사는 잠복기가 8-16시간으로 HBL, NHE, EntFM, CytK 그리고 BceT 등의 독소에 의해 일어나고, 구토는 1-5시간 잠복기를 갖으며 구토독소(Cereulide)에 의해 발병된다.
B. cereus에 의한 식중독은 미국에서 1998년부터 2008년까지 235건이 발생하여 2,050명의 환자가 발병하였으며 집단식중독을 일으킨 전통 음식 52건 중 16건(31%)이 아시아 음식으로 확인되었고 특히 쌀 요리에서 검출되었다고 보고하였다[1]. 우리나라에서 B. cereus로 인한 식중독은 2007년 1건(50명), 2008년 14건(376명)으로 이 중 1건은 구토독소에 의해 발생하였고 2009년에는 보고되지 않았다. 2010년에는 14건(401명), 2011년 6건(98명), 2012년 6건(111명), 2013년 8건(112명), 2014년 11건(49명) 발생하였다.

본 연구에서는 2014년 국내에서 식중독 환자와 식품에서 분리된 B. cereus를 대상으로 유전적 연관성을 확인하고 집단식중독의 원인 규명에 활용하고자 분자생물학적 분석법인 MLST (Multiple locus sequence typing) 시험법을 수행하였다. 또한 MLST 결과와 연관하여 독소유전자의 분포양상을 조사하고 집단 식중독 대비와 전파 여부 등의 규명을 위한 기초 자료로 제공하고자 하였다.

Ⅱ. 몸 말


  수집된 B. cereus의 MLST 분석은 MLST 웹사이트(http://www.pubmlst.org/bcereus)의 분석방법대로 7개의 housekeeping 유전자(glpF, gmk, ilvD, pta, pur, pycA, tpi)의 primer를 이용하여 유전자를 증폭한 뒤, 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 MLST 웹사이트에서 Sequence types (ST)를 확인하였다. 분석대상 균주는 수인성·식품매개질환 실험실 감시망운영 사업(엔터넷)을 통해 설사질환 환자의 인체 분리균주(B. cereus 47주, B. thuringiensis 4주)와 식품에서 분리된 균주(B. cereus 10주)를 대상으로 총 61균주에 대해 수행하였다. B. cereus는 B. thuringiensis와 매우 유사하나 B. thuringiensis는 B. cereus와 달리 cry gene(Crystal 생산에 관여)이 존재하여 cry gene의 존재 유무로 구별할 수 있다[2]. B. anthracis 3균주는 MLST 웹사이트에서 ST 데이터를 다운받아 Grouping을 위한 reference로 사용하였다. B. cereus 57균주의 allele에 대한 분석은 Mega version 6을 이용하여 분석하였다(Table 1).

B. cereus 57균주의 allele에 대한 분석결과, housekeeping allele의 종류는 glpF 유전자가 21가지로 가장 많은 타입을 나타내었고, gmk 유전자가 9가지로 가장 적은 타입을 나타내었다. 하지만 염기서열의 변화가 가장 큰 유전자는 ilvD 유전자로 Average p distance가 0.081을 나타내었고, tpi 유전자가 0.012로 가장 적은 염기서열의 변화를 보였다. 균주의 ST는 총 37종으로 나타났고 이 중 16종(ST992-ST1007, 인체 분리주)은 새로운 ST타입으로 MLST databases에 새롭게 등록하였다. 인체에서 분리된 타입은 23종으로 ST-4, 8, 19, 24, 73, 104, 177, 142, 263, 381, 427, 834, 959, 992, 993, 999, 1000, 1001, 1002, 1004, 1005, 1006, 1007이 발견되었다. 식품에서 분리된 타입은 ST-24, 26, 29, 127 그리고 1003으로 5가지 타입이 10개 균주에서 발견되었다. 전체 분석균주에서 가장 많이 분리된 타입은 ST-24(9균주)이며, 다음으로는 ST-26(6균주)이었으며, ST-24와 ST-26은 각각 인체와 식품에서 공통으로 분리된 타입으로 ST-26은 특히 구토독소를 포함하는 B. cereus로 보고되고 있으며, 주로 쌀밥이나 볶음밥 등의 탄수화물 식품에서 발견되고 있다[3, 4]. 2014년 중국의 검은콩(Douchi)에서 분리된 구토 독소를 지닌 균주도 ST-26에 속한다고 보고되고 있다[5]. 본 연구에서는 ST-26의 분리식품은 찹쌀밥, 흑미밥과 크림스프였다. ST-26 외에 구토 독소를 지닌 Sequence types으로는 ST-31, 45, 47, 144, 164, 165 이 있으나[6, 7, 8] 이번 연구에서는 검출되지 않았다.

ST의 분석을 위해 minimum spanning method를 이용하여 tree를 작성한 결과, 3개의 그룹으로 나뉘는 것을 알 수 있었다(Figure 1). Group I은 ST-4에서 분화된 다양한 ST타입이 포함되어있는 그룹으로 구토형 독소가 포함되지 않으며, 모든 설사형 독소를 포함하고 있는 균주들이 포함되어 있다. 또한, 4개의 ST 타입을 보인 B. thuringiensis도 ST-24로부터 분화되어 Group I에 속하였다. Group II에 포함된 균주는 hblC 유전자를 보유하지 않았으며, CER 구토 독소를 보유하고 있는 ST26이 포함되었다. Group III은 B. anthracis가 포함된 그룹으로 ST163만이 포함되어 있었다.
독소유전자의 분포를 조사하기 위해, B. cereus와 B. thuringiensis의 genomic DNA 추출 후 독소 유전자의 primer를 이용하여 PCR 방법으로 설사형 독소 5가지(hblC, nheA, entFM, cytK2, bceT)와 구토형 독소(CER)의 검출을 확인하였다. 61주를 시험한 결과 hblC, nheA, entFM, cytK2, bceT와 CER 유전자는 각각 65.6%, 100%, 96.7%, 67%, 41%, 10.5%의 비율로 전체 검체 중 nheA 독소유전자는 모두 검출되었고 다음으로 entFM 독소유전자가 검출되었다. 독소유전자 중 가장 적은 분포를 보인 것은 구토 독소(10.5%)였으며, 설사 독소에서는 bceT 독소유전자가 가장 적었다. 구토 독소를 갖는 ST-26의 경우 설사형 독소 중 nheA와 entFM 유전자만을 갖는 특징을 지닌다고 보고되었는데[8, 9], 본 연구에서도 ST-26의 설사형 독소 유형이 같았으며 또한, Group II에 포함된 균주가 유사한 경향을 확인할 수 있었으나, ST-371 균주는 nheA, entFM 독소와 cytK2 독소유전자를 가지고 있었으며, ST-995 균주는 cytK2와 bceT 독소유전자를 가지고 있었다(Table 2).

Ⅲ. 맺는 말


  B. cereus에 의한 식중독은 그람음성세균인 병원성 대장균이나 살모넬라균에 비해 발생빈도가 낮고 증상도 미약하여 종종 치료를 받지 않거나 위험하게 인식하지 않는 부분이 있다. 그러나 B. cereus는 토양 등의 환경에 상재하기 때문에 널리 생존하고 있다가 언제든 생육환경이 좋아지면 단시간 내에 숙주세포에서 증식할 수 있는 능력을 구비하여 위험에 노출되기 쉽다.

MLST 시험법은 PFGE (Pulsed field gel electrophoresis) 분석법과 함께 계통 확인과 집단 식중독에 대비한 원인 규명 실험법으로 이용되고 있다. MLST 시험법은 전 세계에서 동일한 primer와 실험법으로 실험을 진행하고 그 결과를 웹에 등록하여 ST정보를 얻을 수 있으며 자유로이 다른 나라의 ST정보를 다운받아 사용할 수 있어, 분리균주의 특성 파악에 용이한 점이 있다[10]. 하지만 B. cereus에 대한 MLST 분석연구는 많이 이루어지지 않아, 이번 연구가 국내에서 MLST를 이용해 B. cereus를 분석한 첫 번째 보고이다. 또한 기존의 연구에서는 주로 PFGE 분석법으로 식품과 B. cereus의 연관성을 확인한 반면 이번 연구에서는 MLST 시험법으로 식품과 B. cereus뿐만 아니라 설사환자에게서 분리된 B.thuringiensis도 함께 분석하여 연관성을 확인한 점이 발전된 부분이라 판단된다. 이번 연구를 통해 B. cereus 중 구토독소를 가지고 있는 균주는 설사형 독소만을 가지고 있는 균주와는 분자유전학적으로 확연히 구분되는 것을 확인할 수 있었다. 또한 국내 분리되어 새롭게 등록한 균주(16균주)에 대해서는 앞으로 유전자염기서열분석 등을 통한 특성을 분석하여 비교하면 국내 발생균주만의 유전적 특이점을 발견할 수 있을 것으로 예상된다.

B. thuringiensis를 포함한 B. cereus의 특징은 MLST 분석의 grouping결과를 보면 유전적 배경의 다양성을 보였으며, 산발적으로 발생하는 식품 분리균주와 집단 식중독환자 분리균주의 지속적인 자료의 축적이 필요할 것으로 판단된다. 아울러 본 연구 자료는 질병관리 대책 수립의 기초자료로서 활용할 수 있을 것으로 생각된다.

Ⅵ. 참고문헌


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