Abstract


Scrub typhus caused by Orientia tsutsugamushi is well-known acute febrile disease which prevalently occurs in autumn in Korea. The incidence of the disease has increased gradually and 8,130 cases of infection were reported in 2014. For massive diagnosis, reference materials have a role in establishment and quality control for serological laboratory diagnosis of scrub typhus. In this study, internal reference sera for indirected immunofluorescence antibody assay (IFA) of scrub typhus were generated and evaluated. Four strains (Boryong, Karp, Kato, and Gilliam) of O. tsutsugamushi were used as antigen for IFA. Sera of scrub typhus patients were screened and characteristic values for reference materials were evaluated according to the International Organization for Standardization (ISO) guide 34 and 35. Two reference sera for IgM antibody titers (1:64 and 1:1,024) and 4 reference sera for IgG antibody titers (1:64, 1:256, 1:1,024, and 1:2,048) were obtained. Each serum has been confirmed for stability for short-term and long-term storage and homogeneity within vials and in inter-vials. Characteristic values for IFA were confirmed by a series of comparison evaluation between the different laboratories and different testers. The reference sera produced under the ISO guide 34 and 35 were useful for standardization of serological laboratory diagnosis of scrub typhus.


  쯔쯔가무시증은털진드기 매개질환으로, 대표적인 가을철 발열성질환의 하나이다. 2000년대 초반 5,000-6,000천 명에 달하였던환자의 수가 최근크게 증가하여 2013년에 10,365명, 2014년에는 8,130명의 환자가 신고되었다. 쯔쯔가무시증과 같은리케치아성 매개질환은 정확한 조기진단이 치료 및환자의 치료예후에 미치는 영향이매우 크다. 국립보건연구원 인수공통감염과는 신속·정확한 진단을 위하여 2011년부터간접면역형광항체법(Indirect Immunofluorescence Antibody Assay, IFA)을이용한 혈청학적 검사를 표준시험절차로 확립하고[문서번호 KCDC-QIMZ-03], 각 시·도보건환경연구원으로이관하여 확인 진단을 수행하고있다. 또한 매년4월 신규 실험실 검사수행자를 위한 교육(한국보건복지인력개발원의 진드기및 설치류 매개질환 실험실진단 과정)과수행 기관을 대상으로 한실험실 검사 정도관리를 통해실험실 검사의 질적 향상을 도모하고 있다.

표준물질(reference materials)이란 측정 과정에 사용할 목적으로 만들어진 하나 이상의 명기된 특성에 관하여 충분히 균질하고 안정된 물질을 말한다[1]. 국제 표준화 기구 (International Organization for Standardization, ISO)에서는 세계 각국에서 생산한 특정 표준물질을 세계 모든 국가가 사용할 수 있도록 국제 표준물질 데이터베이스(Code of Reference Material)를 운영하고 있다[2]. 또한, 세계보건 기구(World Health Organization, WHO)는 각종 질병의 예방 또는 진단에 사용되는 체외진단용의약품의 개발, 평가, 표준화 및 관리를 위해 협력기구(Collaborating Centre for Biological Standards and Standardization)를 지정하여 국제 생물학적 표준물질을 제조·공급하고 있다[3]. 그러나, WHO에서 매년 지정하여 공개하는 국제 표준물질(International standards, IS) 목록에는 현재까지 쯔쯔가무시증 진단을 위한 표준항혈청 표준물질이 포함되어 있지 않다. 따라서, 본 기관에서는 시험 검사기관에 보급 및 정도관리를 목적으로 국제기준(WHO technical report series 932 및 ISO Guide 34)에 부합하는 쯔쯔가무시증 혈청학적 검사용 표준물질을 생산하여 평가 하였다.

표준물질 생산 계획과 절차는 상기한 국제 기준에 따라 Table 1과 같이 설계하였으며, 1:16부터 1:2,048까지 2배씩 단계 희석한 혈청의 항체가 중 저농도를 포함한 6종(IgG 1:2,048, IgG 1:1,024, IgG 1:256, IgG 1:64, IgM 1:1,024, IgM 1:32)의 농도로 구성하였다. 원료물질의 적합성 평가와 생산한 표준물질의 안정성과 균질성을 확보하기 위한 방법으로 수행하는 IFA법은 신뢰도가 높은 표준 항원 슬라이드가 필요하다. 따라서 먼저 표준 항원 슬라이드를 제작하기 위하여, Table 2와 같이 항원액을 생산한 후 쯔쯔가무시 특이 유전자 (TSA56 및 ScaD)로 최종 확인하였다. 생산된 표준 항원액으로 Table 3에 따라 항원 슬라이드를 제작하고, 균질성 및 안정성을 평가하였다. 균질성 평가는 생산된 슬라이드 중 무작위로 10장을 선택하여 IFA를 수행한 후 각 well에서 균의 수가 현미경 400배 배율에서 관찰 시 시야 당 (2,000 ± 20) %가 유지되는지 확인하였으며 안정성 평가는 Table 4와 같이 온도별, 시간별 차이를 두고 보관된 항원 슬라이드로 균질성에서 제시한 균수가 유지되는지 확인하였다. 시야 당 균수의 계수는 아래의 방법으로 수행되었다.
수행 결과, 시야 당 평균 1,600개-1,800개의 균이 확인되어 균질성이 확보되었고, 단기 안정성 평가에서는 상온을 제외한 보관온도에서 안정한 것으로 확인되었다.

항혈청 원료물질은 비교적 쯔쯔가무시증 환자 발생빈도가 높은 전라도 지역의 조선대학교병원을 협력병원으로 지정하여 쯔쯔가무시증의 임상증상을 가지고 내원한 환자 중 감염이 확인된 환자로부터 채혈하였고, 수집된 후보 혈액은 표준 항원슬라이드를 사용하여 IFA법으로 항체가를 측정하였다. 또한, 쯔쯔가무시증과 유사한 임상적 특성을 가지는 발진열과 홍반열에 대한 감염 여부를 Rickettsia specific 16sRNA 유전자의 증폭 및 염기서열 분석으로 확인하여 모두 음성인 원료물질(혈액)을 선별하였다.

선별한 원료물질은 혈청화하여 IFA법으로 항체가를 재확인하였다. 최종 IgM 2종(1:1,024 및 1:32)과 IgG 4종(1:2,048, 1:1,024, 1:256, 1:64)을 확보하였고, 확보된 혈청은 위탁기관에서 0.1㎖/vial로 소분하여 후보표준물질로 제조하였다.
후보표준물질의 병간 균질성을 확인하기 위하여 생산된 vials 중 10개를 무작위 선별하여 IFA법을 3번 반복하여 항체가를 측정하였다[4]. 균질성 평가의 기준은 각 vial에서 3회 반복 시험결과가 ‘특정 항체가 ± 1단계’에 속하며, 2회 이상 동일한 항체가가 나온 경우를 최종값으로 선정하고, 선별한 10 vial 중 80% 이상에서 최종값과 동일한 항체가가 확인된 경우 균질하다고 판정하였다. 그 결과 모두 특정 항체가와 동일한 결과를 나타내어 균질성이 확인되었다.

또한, 안전성은 운송가능 온도(-20℃, 4℃, 25℃)를 확인하기 위한 단기 안정성과 적정 보관온도(-70℃)에서 유효기간 산정을 위한 장기 안정성으로 나누어 확인하였다(Table 4)[4]. 단기안정성 결과는 생산된 6종류의 표준물질 중 IgG 1:256 항체가 혈청이 상온(25℃)에서 7일차에서부터 1단계 감소하였으며, IgM 1:1,024 항체가 혈청은 상온(25℃)에서 14일차에 급격히 7단계 감소하였다. 또한, IgG 1:64, IgM 1:32 항체가 혈청이 상온(25℃)에서 14일차에서부터 1단계 감소 하였다. 두 온도를 제외하고 모든 표준물질이 냉장(4℃)에서 2개월 동안 안정함을 확인하였다. 제조된 표준물질의 유효기간 산정을 위한 장기 안정성은 현재 4개월까지 진행하였다. 장기 안전성 평가의 기준은 시험 중 균질성 평가와 동일하게 80％ 이상의 최종 항체가가 특정값과 일치하며 오차 범위는 ‘특정 항체가 ± 1단계’ 이내 일 경우 안정한 것으로 판정하였다. 그 결과 현시점에서 각 표준물질의 특정값과 동일한 항체가가 확인되어 4개월까지 안정하다고 판정하였으며, 2년 유효기간을 확인하기 위하여 향후 8개월, 12개월, 24개월까지 지속적으로 모니터링 할 계획이다.

생산된 표준물질의 특성값 부여를 위한 기준은 생물학적 특성을 고려하여 기준을 마련하였으며, 시험소간 공동시험 분석으로 설정하였다. 설정 기준은 8개 이상의 시험소에서 나온 결과를 바탕으로 각 시험소의 최종 항체가를 기하평균으로 산출하며 95% 신뢰구간을 설정하였다. 향후, 시험소간 공동 분석을 통하여 최종 특성값을 부여할 예정이다.
본 과제에서는 상기한 국제적 기준에 따라 쯔쯔가무시증 표준항혈청 생산, 적합성 평가를 수행하여 생물학적 표준물질 기준에 상응하는 기관 내 표준물질을 개발하였다. 따라서 생산·개발된 쯔쯔가무시증 표준항혈청은 향후 본 기관에서 관리·은영하는 혈청학적 검사의 정도관리 표준물품, 혈청학적 진단과 관련 연구개발 과제에서 대조물질 등으로 활용될 예정이다. 

< 참고문헌>


1. 한국표준협회. 2012. 표준물질 생산기관의 적격성에 대한 일반적 요구사항-KS A ISO GUIDE 34.
2. PHWR. 2015. HIV 인간항혈청 표준물질의 생산 및 적합성 평가 연구.
3. Department of Health and Human Services(DHHS). 2007. Guidelines for the use of antiretroviral agent in HIV-1-infected adults and adolescents.
4. 질병관리본부. 2014. 레지오넬라 항원, 항혈청 및 쯔쯔가무시 항혈청 생산 및 분석.