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국내에서 서식하고 있는 쯔쯔가무시증 매개 대잎털진드기 유전체 및 전사체 분석
  • 작성일2015-10-08
  • 최종수정일2015-10-08
  • 담당부서질병매개곤충과
  • 연락처043-719-7166
국내에서 서식하고 있는 쯔쯔가무시증 매개
대잎털진드기 유전체 및 전사체 분석
Analysis of the Genome and Tranome of the Chigger Mite Leptotrombidium pallidum,
a Major Vector of Scrub Typhus in Korea


서울대학교 농업생명과학대학 농생명공학부
곤충분자생물학 및 독성학 연구실
질병관리본부 국립보건연구원 면역병리센터
질병매개곤충과
이시혁, 김주현, 윤경재, 노종열, 신이현, 주영란*

* 교신저자(juyran@korea.kr/ 043-719-8560)

Abstract


TIn Asian countries including Korea, Leptotrombidium pallidum is the major vector mite for Orientia tsutsugamushi, the causative agent of scrub typhus. Genomic DNA (gDNA) was extracted from a single female from a 9-generation inbred L. pallidum colony and used for whole genome amplification (WGA). The resulting amplified gDNA was used for the construction of paired-end and mate-pair libraries and sequenced using Illumina platforms (HiSeq2000 and MiSeq). More than 45Gb sequence reads from both paired-end and mate-pair libraries of the WGA gDNA were trimmed. Then, de novo was assembled using the CLC Asembly Cell v.4.0 for contig assembly and SSPACE for scaffolding. The assembly generated approximately 6,545 scaffolds with N50 value of 92,945 and total size of 193 Mb, which was in a good agreement with our previous estimation. Repeat analysis showed that about 30% of genome (58 Mb) was masked as repeats, most of which were unclassified novel elements. For gene predictions, PASA models were generated based on genomic alignments of RNA-seq reads from four different chigger mite samples (i.e. male, female, larva, and protonymph). GeneWise models were also generated based on genomic alignments of protein sequences from four closely-related species of chigger mites. Independently, ab initio gene predictions were performed with AUGUSTUS and FgeneSH with custom-trained matrices optimized for L. pallidum and GENEID with pre-trained matrix for Acyrthopsiphon pisum. By combining all of these together, 15,842 genes were finally predicted. As a result of manual annotation, a total number of 456 genes were verified and characterized in various genetic groups including salivary gland, chemosensory receptor genes, immune-related genes, acaricide target genes, detoxification genes and RNAi-related genes.


Ⅰ. 들어가는 말

  그람음성균인 Orientia tsutsugamushi가 유발하는 쯔쯔가무시증은 고열과 발진을 동반하며 적절한 항생제 치료 없이는 치사율이 40%에까지 이르는 급성 열성질병이다[1].
이 질병은 일본, 한국, 중국, 인도, 파키스탄, 오스트리아 및 러시아 동부에 이르기까지 널리 분포하며, 매년 백만 건 가량이 발생하고 10억 이상의 사람들이 감염의 위험에 노출되어 있는 것으로 알려져 있다[2]. 털진드기과(Trombiculidae)에 속하는 진드기가 매개체의 역할을 하며, 발달단계 중 유일하게 사람의 체액을 섭취하는 유충이 체액을 섭취하는 과정에서 균의 전파가 이루어지게 된다.

털진드기과 중 본 연구의 대상종인 대잎털진드기(Leptotrombidium pallidum)는 한국과 일본, 러시아에 널리 분포하며 한반도와 일본의 주된 매개종이다. 쯔쯔가무시증 이외에도 최근 Leptotrombidium 속의 진드기가 한타바이러스[3] 및 Bartonella tamiae[4] 역시 보유하고 있다는 연구결과가 있어 일반적으로 알려진 것 이상으로 넓은 범위의 병원체 매개에 관여할 가능성이 시사되고 있다. 털진드기 뿐만 아니라 다양한 종류의 진드기/응애류(Acariform/Parasitiform)는 인간 및 가축질병을 매개함으로써 전 세계적으로 보건상의 큰 위협이 되고 있으나 이러한 의학적 중요성에도 불구하고, 대잎털진드기에 대한 분자생물학적 정보는 거의 알려져 있지 않다. 또한 질병매개력과 관련된 분자생물학적/유전학적 기반이 부족함에 따라 털진드기의 방제 및 질병전파 억제를 위한 효율적인 방안 모색도 어려운 실정이다. 현재까지 알려진 진드기류 유전체는 Parasitiform에 속하며 라임병을 매개하는 사슴진드기(Deer tick, Ixodes scapularis)에 국한되어 있으므로 진드기류(Acariform)의 유전체에 대한 연구가 시급하다. 따라서 국내에서 서식하고 있는 대잎털진드기의 유전체 및 전사체 분석을 통해 향후 털진드기 관련 연구의 기초자료를 확보하고자 하였다.

Ⅱ. 몸 말


대잎털진드기의 유전체 및 전사체 분석
  우수한 유전체 분석 결과를 얻기 위해서는 단일개체로부터 얻은 gDNA를 이용하여야 하나, 대잎털진드기의 경우 성충의 크기가 매우 작아 유전체 분석이 필요로 하는 충분한 양의 gDNA를 추출하는 것이 불가능하다. 따라서 본 연구에서는 whole genome amplification(WGA)법을 통해 7세대간 누대사육된 암컷 성충으로부터 추출한 gDNA를 증폭한 후 Illumina paired-end와 mate-pair sequencing을 사용해 유전체 분석을 시도하였다. 분석된 총 47.9 Gb의 염기서열을 기반으로 assembly를 수행하여 193.7 Mb의 scaffold를 얻었고, k-mer analysis를 통해 유전체 크기를 175 Mb로 추정하였는데, 이 유전체 크기는 유연관계의 진드기류(Acariform)와 유사한 것으로 보인다. 현재까지 유전체 분석이 완료됐거나 혹은 여러 다른 문헌에서 유전체 크기가 추정된 거미강 절지동물들, 즉 사슴진드기(Ixodes scapularis), Southern cattle tick(Rhipicephalus microplus), 꿀벌응애(Varroa destructor), Western predatory mite(Metaseiulus occidentalis), Tropical moss mite(Archegozetes longisetosus), 집먼지진드기(Dermatophagoides pteronyssinus), 면양옴진드기(Psoroptes ovis), 옴진드기(Sarcoptes scabiei), 점박이응애(Tetranychus urticae), 활순털진드기(Leptotrombidium scutellare)와 비교해 볼 때(Figure 1), 이는 Parasitiformes의 참진드기류보다는 확연히 낮으나 같은 Acariformes 상목에 속하는 종들에 비해 높은 수치이며, 특히 동일한 Trombidiformes 목으로 분류되는 점박이응애(90 Mb)의 약 2배에 달한다. 또한 동일한 속의 활순털진드기(L. scutellare)보다는 28% 적은 유전체 크기를 보였다. 두 종은 거의 동일한 생물학적/생태적 특성을 지니고 있으므로, 이러한 두 근연종 간의 유전체 크기 차이는 non-coding sequence로부터 기인한 것으로 생각된다.

해당 염기서열 분석 결과를 바탕으로 evidence-based 및 de novo approach를 통해 15,842개의 protein-coding 기능적 유전자를 밝혔으며 평균 1,511 bp의 길이 및 2.4개의 exon이 존재함을 확인하였다. 대잎털진드기 내부에 존재하는 공생미생물의 염기서열을 분석한 결과, 평균 967 bp의 1,820개 contig가 발견되었으며 그 중 Mannheimia haemolytica(12.16%)와 Microbacterium laevanformans(12%)가 차지하는 비율이 가장 높았다. Mitochondrial genome의 경우, 기존에 알려져 있던 대잎털진드기의 데이터와 비교하여 95% coverage 내 87%의 일치를 확인하였고 20종의 tRNA와 2종의 rRNA를 포함한 13개의 protein coding gene이 발견되었다. 한 마리 개체로부터 유전체분석을 수행하기에 충분한 양의 genomic DNA 확보가 어려운 상황임에도 WGA를 통해 소량의 genomic DNA를 증폭하고 이로부터 차세대염기서열분석(next generation sequencing) 및 de novo assembly를 거치는 도전적인 시도를 하였으나 결과적으로는 상당히 신뢰성 높은 초벌 유전체를 얻은 것으로 판단된다(Table 1).

유전체 분석과 동시에, 유충, 전약충, 수컷 성충 및 암컷 성충을 대상으로한 전사체 분석을 수행하였다. 각각의 라이브러리 내 유전자 발현을 조사한 결과 약 75%의 유전자가 모든 발달단계에서 고르게 발견되었으며, 유충 내 1,861종, 전약충 내 923종, 수컷 성충 내 1,305종, 암컷 성충 내 565종의 유전자가 각 발달단계별 상이한 양으로 발현되는 것이 관찰되었다. 특히 유충 내에서는 2,109개의 유전자가 특이적으로 발현되었으며 이는 대부분 세포벽 및 세포골격의 modification 등 cellular process에 관여하는 것으로 보인다. 앞서 언급한 바와 같이 대잎털진드기는 여러 발달단계 중 오로지 유충 시기에만 사람에게 병원체를 전파하므로, 해당 전사체의 심도 있는 분석을 통해 질병매개에 관여하는 유전정보를 밝힐 수 있을 것으로 생각된다.


대잎털진드기의 유용유전자 탐색
  완성된 본 초벌유전체를 바탕으로 하여, 대잎털진드기의 주요 6개 유전자군인 침샘, 화학수용체, 면역, 살비제 작용점, 해독작용, RNAi 관련 유전자들을 manual annotation 한 결과, 총 456개의 유전자를 확보하였다(Table 2). 대잎털진드기에서도 사람에게 라임병을 매개하는 deer tick과 유사한 종류의 침샘 유래 유전자들이 다수 발견되었다. 본 유전자들은 털진드기의 체액 섭식을 연구하는 데에 있어서 분자생물학적 기반을 제공하며, 미국 등지에서 시도된 Acquired tick resistance (ATR)에서와 유사한 표적으로서의 가치가 있을 것으로 생각된다. 향후 이들 침샘펩타이드(Salivary peptide)의 발현량을 조사하고 발현량이 우수한 펩타이드를 선발하여 ATR의 immunogen으로 활용하는 연구가 필요할 것으로 보인다.
대잎털진드기의 화학수용체 관련 유전자들은 본 유전체로부터 현재까지 45종이 동정되었으나 이들의 후각/미각수용체로서의 정확한 기능을 유추하기 위해서는 각 유전자의 발육단계별, 조직학적 발현 양상에 대한 분석뿐만 아니라, 발현을 통한 기능검정과 같은 후속 연구가 필요할 것으로 보인다. 최근에 보고된 DEET(N,N-diethyl-meta-toluamide) 감지 수용체로서 제시된 초파리 IR40a의 상동유전자는 발견되지 않았으나 유사한 ionotropic receptor 7종이 존재하고 기피제 감지 수용체로 추정되는 transient receptor potential channel도 2종이 발견되었으므로 이들의 신경생리학적 연구가 요구된다. 쯔쯔가무시증의 감염을 억제하기 위한 가장 효과적인 방법은 매개체인 털진드기와 인간의 접촉을 최소화하는 것이므로 효과적인 털진드기 기피제의 개발이 필수적이나 아직 체계적인 기피제 개발 연구가 진행되고 있지 않은 실정이다. 기피제 감지에 관여하는 수용체나 주요 후각/미각수용체 발현 곤충세포주를 확보한다면 이를 기반으로 한 유인살상제 및 기피제 개발이 가능하여 쯔쯔가무시증의 발발 억제에 크게 기여할 것으로 사료된다.

대잎털진드기에서 발견된 면역과 관련된 유전자는 총 85개이며 그 중 초기의 pathogen 인지와 관련된 것이 Peptidoglycan recognition protein, C-type lectin, Galectin, TEP(Thioester-containing protein), Scavenger receptor 등 총 5종 25개 유전자이다. O. tsutsugamushi 감염 및 비감염 대잎털진드기 계통을 확보하여 면역관련 유전자의 발현양상 차이를 조사한다면 쯔쯔가무시 질병매개에 관여하는 주요 면역인자의 동정이 가능할 것으로 판단된다. 대잎털진드기에는 그람음성세균의 면역에 관여하는 IMD(Immune deficiency) pathway가 존재하지 않으므로 O. tsutsugamushi을 비롯한 병원성 그람음성세균에 대한 체액성 면역반응이 약화되어 있을 것으로 예측되며 이것이 대잎털진드기가 가지는 높은 질병매개력의 주요 원인으로 사료된다. 그러나 대잎털진드기와 O. tsutsugamushi를 비롯한 병원성 세균과의 상호작용을 이해하기 위해서는 대잎털진드기의 면역에 미치는 공생미생물의 영향에 대한 심도 있는 연구도 수반되어야할 것으로 생각된다. 최근에는 공생미생물의 구성에 따라 진드기의 anaplasma증 매개율이 크게 차이가 나는 것으로 보고되고 있으므로 지역별 대잎털진드기 계통간의 공생미생물 구성 차이뿐만 아니라 질병매개력이 높은 대잎털진드기류와 낮은 대잎털진드기류 간의 공생미생물 titer 및 구성에 대한 연구가 필요할 것으로 보인다.

대잎털진드기 유전체에서는 기존에 알려진 모든 살비제 작용점 유전자(acetylcholinesterase, voltage-sensitive sodium channel, acetylcholine receptor, GABA receptor, glutatmate-gated chlororide channel 등)가 발견되었으므로 현재 상용화되어 있는 각종 살비제를 대잎털진드기 방제에도 사용할 수 있을 것으로 보인다. 이들 살비제 작용점 유전자들의 아미노산서열을 인간을 비롯한 포유동물과 여타 절지동물의 상동유전자 서열과 비교분석하고 살충·살비제 민감도 및 저항성에 관여하는 아미노산 잔기를 파악하여 효력이 우수한 살비제를 in silico 선발하는 것이 필요할 것으로 보인다. 더불어 최근에 개발된 신규 살충·살비제의 주 작용점인 ryanodine receptor유전자도 발견되었으므로 이들의 특성 분석을 통해 인축독성이 낮으나 대잎털진드기에 효과적인 신규 살비제 개발도 필요할 것으로 판단된다. 나아가서 비교유전체 연구를 통한 대잎털진드기류에 특이적으로 존재하는 신규 작용점 유전자를 발굴하여 대잎털진드기의 선택적 신규 살비제 탐색도 가능할 것으로 보인다.

Ⅲ. 맺는말

  현재까지 진행된 대잎털진드기의 유전체 분석은 질병매개력 연구와 살비제 및 억제제에 대한 새로운 작용점 개발, 그리고 최종적으로는 쯔쯔가무시증의 효율적인 예방법 연구를 위한 기초적 유전정보를 제공할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 숙주인 사람과 병원체인 O. tsutsugamushi의 유전체 분석은 완료되어 있으므로, 매개종인 대잎털진드기의 유전체 정보는 숙주-병원체-매개체간의 상호작용 이해 및 거미강 유전체의 진화 연구에도 중요한 자료로 이용될 것으로 기대된다.

Ⅳ. 참고문헌


1.Tamura A, 1995. Tsutsugamushi Disease and Rickettsia tsutsugamushi - Especially on the Transmission Process and Antigenic Variation of the Rickettsia, Jpn J Tox Env Health. 41(3):179-193.
2. Lerdthusnee K, Khlaimanee N, Monkanna T, Sangjun N, Mungviriya S, Linthicum KJ, Frances SP, Kollars TM, Coleman RE. 2002. Efficiency of Leptotrombidium chiggers (Acari : Trombiculidae) at transmitting Orientia tsutsugamushi to laboratory mice, J Med Entomol. 39(3):521-525.
3. Houck ML, Kumamoto AT, Gallagher DS, Benirschke K. 2001. Comparative cytogenetics of the African elephant (Loxodonta africana)and Asiatic elephant (Elephas maximus), Cytogenet Cell Genet. 93(3-4):249-252.
4. Kabeya H, Colborn JM, Bai Y, Lerdthusnee K, Richardson JH, Maruyama S, Kosoy MY. 2010. Detection of Bartonella tamiae DNA in Ectoparasites from Rodents in Thailand and Their Sequence Similarity with Bacterial Cultures from Thai Patients, Vector-Borne Zoonot. 10(5):429-434.


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