Abstract


Background: Microbial identification is an important item to characterize the pathogen in managing its resources. Unidentified pathogens in automated identification system are identified using genetic, biochemical analysis and developed as a national resources in this study.
Methods: For this study, we collected 437 unidentified strains from branch banks of NCCP for collecting pathogens. 16s rRNA gene sequencing was performed for the comparision of sequence similarity. Subsequently, the novel species candidates were selected based on the degree of sequence similarity. Temperature, pH, the growth with the NaCl tolerance was observed and VITEK II was investigated for biochemical identification. Phylogenetic analysis based on 16s rRNA gene was performed using PHYDIT program. Gene alignment, production of the phylogenetic tree was used for neighbor-joining method based on Juke's Cantor model.
Results: Eight strains exhibiting less than 98.65% 16S rRNA gene similarity with known species were selected as the primary candidates for novel species, and 25 strains exhibiting 98.65~99.0% similarity were also selected as possible candidates for novel species. Among the primary candidates, Dermabacter sp. and Ewingella sp. stains were finally selected as the possible strain for novel species. In these strains additional experiments, such as genome sequencing, DNA-DNA hybridization etc, are in progress. And 15 species 15 strains were new registered in pathogen information management system (PIMS).
Conclusions: As in this study, human pathogens unidentified using automated identification systems are expected to be unknown taxa included and these missing pathogens were developed as national resources. Continuously collecting and analyzing these pathogens is considered to be very important because it is subject to be novel species candidates for obtaining a useful standard resources.


Ⅰ. 들어가는 말


  병원체(pathogen)란 세균, 바이러스, 프리온, 진균 등이 숙주에게 질병을 일으킬 수 있는 감염체(Infectious agent)를 의미한다. 병원체는 질병을 야기할 수 있다는 측면에서 위험성을 동반하고 있지만, 한편으로는 예방백신개발 등을 위한 잠재적 가치성을 보유하고 있는 양면성을 가지고 있다[1]. 질병관리본부 국립보건연구원 병원체자원관리TF에서는 국가병원체자원은행(National Culture Collection for Pathogens; NCCP, http://www.kdca.go.kr) 운영을 통하여 인체에 감염을 일으키는 병원성 미생물을 국가차원에서 수집하고 매년 수백 건의 병원체를 자원화하여, 이를 질병의 예방, 진단, 백신 및 신약 개발 등의 보건의료를 연구하는 연구자들에게 제공하고 있다[1]. 현재 분양 가능한 병원체자원은 615종 2,063주이며 공공기관을 비롯하여 산·학·연 관련기관의 보건의료분야 연구에 매년 1,000건 이상이 분양되고 있다(Table 1).

NCCP에서는 유용병원체자원을 확보하기 위하여 다양한 수집체계를 운영하고 있다. NCCP에서 수집 운영하고 있는 자원은 국내 환자에서 분리된 감염성 병원체이고 질환의 임상증상과 역학정보를 포함하고 있어 국내 질병의 진단, 치료 및 예방을 위한 연구에 중요한 자원으로 활용될 수 있다(Figure 1)[2]. 이러한 병원체자원을 보존·관리함에 있어 미생물동정은 병원체의 특성을 구분하는 매우 중요한 항목이라 할 수 있다.

미생물동정은 전통적으로 현미경을 이용한 표현형과 생화학적 특징을 이용하여 수행하고 있으나[3] 이 방법은 많은 시간이 소요되고, 실험자의 숙련도에 따라 결과의 판정에 오류가 다소 발생할 수 있는 단점이 있다[4]. 이러한 문제를 해결하고자 개발된 미생물 자동화 동정기기는 연구 및 산업적인 곳에 많이 활용되고 있다. 자동화동정시스템을 위한 장비로는 지방산의 비율을 분석하는 Microbial Identification System(MIDI), 생화학적 특성을 이용한 VITEK[4], 질량분석기를 이용한 Matrix-assisted laser desorption /ionization Time of flight (MALDI-TOF)이 있다(Figure 2)[5]. 이러한 자동화 동정시스템들은 분석에 상대적으로 시간이 걸리는 16s rRNA의 계통진화분석보다 다수의 균주를 신속하고 간편하게 분석할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 국가병원체자원은행의 수집자원 네트워크의 하나인 거점은행에서도 VITEK Identification System을 미생물동정에 사용하고 있다. 이 시스템은 기존에 연구된 결과와 새로이 분석할 미생물을 컴퓨터를 이용하여 결과를 판정하여, 미생물 동정에 소요되는 시간이 짧다는 장점이 있지만 확인된 생화학적 데이터만 이용할 수 있어 확인된 자료가 있는 일부의 대상 병원체에만 유용한 한계가 있다[6].

본 연구에서는 자동화장비에서 동정되지 않는 병원체를 분자유전학 및 생화학적 분석을 추가 수행 후 확인동정하여 자원화하는 내용을 기술하고자 하였다.

Ⅱ. 몸 말


분자유전학적 분석
  본 실험에서는 거점은행에서 수집된 자동화시스템에서 미동정 병원체 437주를 대상으로 분석 하였다. 최근 세균의 종 수준에서의 핵심적인 분류 지표는 DNA-DNA 유사도로서 세균의 경우 종간 DNA 유사도가 70% 미만이면 신종으로 분류하고 있다. DNA-DNA 유사도 70%에 상응하는 16S rRNA 유전자 유사도 수치는 98.65%로 보고되고 있다[7]. 미동정병원체 437주 중 16S rRNA 유전자 유사도가 98.65% 미만으로 동정된 균주들을 신종 후보 I군으로 정의하였고 총 8균주가 분류되었다. 16S rRNA 유전자 유사도가 98.65% 이상이라도 DNA 유사도 70%는 미만을 나타내는 경우가 많으므로 16S rRNA 유전자 유사도가 98.65-99.0% 사이의 균주들을 신종 후보 II군으로 정의하였고 총 24균주가 신종 후보 II군으로 분류되었다(Table 2, 3).

신종 후보 I, II군으로 분류된 32균주를 대상 16s rRNA를 이용한 계통분석을 수행하였다. 16s rRNA 유전자 염기서열의 phylogenetic 분석은 PHYDIT program(ver 3.1)을 이용하였다[7, 8]. 염기서열 alignment 및 계통수 작성은 neighbor-joining 방법을 이용하였으며 Juke’s Cantor의 one parameter model에 의해 계통수 분석을 하였다[9]. 이중 Dermabacter sp 와 Ewingella sp. 2주는 신종의 가능성이 높다고 추정하였다 (Figure 3).

생화학적 특성분석
  신종 후보 Ⅰ, II군으로 분류된 총 32균주를 대상으로 온도, pH, NaCl 내성에 따른 생장범위를 관찰하였으며 Vitek II 이용하여 생화학적 특성을 분석하였다. 이중 Dermabacter sp.의 특성은 다음과 같다(Table 4).

신종탐색, 미등록자원 자원화
병원체자원은행 네트워크를 통해 수집된 병원체자원 중 자동화장비로 동정이 어려운 국내 임상분리주에 대하여 16s rRNA 유전자 염기서열 98.65% 이하의 상동성을 나타내는 균주를 선별하고 16s rRNA를 기반으로한 phylogenetic analysis를 통하여 신종 병원체 발굴을 위한 후보주 pool을 마련하였다.
현재 계통분류학상 같은 그룹으로 분류되는 균주들을 대조균주로 선정하고 이를 확보한 상태이며 향후 대조균주와의 생화학적 특성 비교, DNA-DNA hybridization 분석, Full genome sequencing 비교분석 등 신종 병원체 자원발굴을 위한 추가 실험을 진행하고 있는 상태이다. 또한 전체 437주 중 신종후보주 2주를 제외한 나머지 균주의 16s rRNA 유전자 염기서열 분석결과 국가병원체자원은행(NCCP)에 현재까지 등록되지 않은 미확보 병원체 15개종의 각각 1주씩 15주가 확인 동정되어 신규 자원화 하였다(Table 5).

Ⅲ. 맺는말


원병원체자원의 전통적인 동정방법 실험에 소요되는 시간과 실험자의 숙련도에 따라 결과의 판정에 오류가 포함 될 수 있고 업무의 효율적인 면에서도 미생물 자동화 동정기기를 활용한 방식이 현 추세이다. 그러나 자동화 동정시스템에 의한 병원체 동정은 분석 할 수 있는 종의 범위가 300여종으로 한정되어 있고, 그 동정 원리가 현재의 원핵생물 분류체계와 일치하지 않아 이를 이용한 결과에서 미동정 균주가 포함되는 것은 필연적이라고 할 수 있다. 자동화장비에서 미확인된 병원체는 유전학적, 생화학적 분석을 추가하여 동정하여야하며, 이를 보완할 수 있는 시스템의 도입이 필요하다. 국가병원체자원은행에서는 보완장비로 보완동정시스템인 MALDI-TOF MS를 적용하고 있다.
자동화동정시스템으로 미동정된 병원체 중에서는 아직 알려지지 않은 신분류군들이 포함될 수 있으며 이를 확인 동정하여 유용한 국가자원으로 개발하는 것이 국가병원체자원은행의 중요한 임무라고 본다. 또한 병원체들을 수집하고 분석하는 업무는 산업적으로 유용한 표준자원 확보 및 제공을 위하여 지속적으로 요구되고 있다.

Ⅳ. 참고문헌


1. 이광준. 2011. 국가병원체자원은행 소개 및 추진현황. 주간건강과질병. v.4, n.22, p.392-395
2. 한순영. 2013. 국가병원체자원은행 연보. p.4-65
3. Mohr O’Hara C, Weinstein MP, Miller JM. 2003. In: Murray PR (ed) Manual of clinical microbiology, 8th ed. ASM, Washington, DC. 185-07.
4. 권주리, 박진숙 2002. Vibrio 속 세균 동정에 대한 자동화동정 시스템의 비교. Korean Journal of Microbiology v.38, p.62-66.
5. Anderson Fernandes Santos et al. 2013. Evaluation of MALDI-TOF MS in the microbiology laboratory. J Bras Patol Med Lab v.49, n.3, p.191-197, junho.
6. Funke G, Monnet D, deBernardis C, von Graevenitz A, Freney J. 1998. Evaluation of the VITEK 2 system for rapid identification of medically relevant gram-negative rods. J Clin Microbiol. 36, 1948-1952.
7. Chun J, MC Kim. 2014. Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes. 2014. IJSEM 64, 346-351
8. Chun J, Lee JH, Jung Y, Kim M, Kim S, Kim BK, Lim YW. 2007. EzTaxon: a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences. Int J Syst Evol Microbiol. 57, 2259-2261.
9. Saitou N & Nei M. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol. 4, 406-425.