Abstract

BACKGROUND: The bacteria Bacillus cereus is widely present in nature and has the ability to survive in harsh environments. B. cereus causes two types of gastrointestinal diseases: emesis and diarrhea. It produces one emetic toxin (cereulide) and several enterotoxins (entFM, nheA, cytK2, hblC and bceT). We investigated the prevalence and toxin type characteristics of enterotoxic and emetic Bacillus cereus isolated from the laboratory surveillance system in Korea from 2012 to 2015.
METHODOLOGY: A total of 900 B. cereus strains were collected by the National Research Institute of Health (NIH) laboratory surveillance system from 2012 to 2015. Collected strains were analyzed according to isolated season and patient age. Additionally, the presence of enterotoxic and emetic toxin genes was analyzed.
RESULTS: The isolation rate of B. cereus strains increased during the summer, and the ages of positive cases were highest from those 60 to 69 years old. 80.2% of B. cereus have enterotoxin genes (enterotoxic strain) and 19.8% have enterotoxin and emetic toxin genes (emetic strain). The prevalence of five enterotoxin genes (entFM, nheA, cytK2, hblC, and bceT) amongst enterotoxic strains was 89.1%, 82%, 51.8%, 45.8%, and 41.4%, respectively, and prevalence in emetic strains was 78.7%, 59.0%, 14.6%, 9.0%, and 11.2%, respectively. Thus, distribution of the five enterotoxin genes was lower in emetic B. cereus.
CONCLUSIONS: Based from the results, the prevalence of enterotoxin genes was lower in emetic strains as compared to enterotoxic strains. Specifically, entFM and nheA genes were the major enterotoxin genes found in both enterotoxic and emetic strains isolated in Korea. The prevalence of cytK2, hblC, and bceT genes was low in emetic strains.


들어가는 말

Bacillus cereus는 식중독 및 설사질환을 일으키는 지정감염병의 원인균 중의 하나로써, 환경에 퍼져있어 각종 식품에 오염될 수 있는 병원균이지만, 병원체 진단에 어려움을 일으키는 주요 균이기도 하다[1, 2]. B. cereus는 내열성 아포를 형성하는 그람양성 간균이며, 운동성이 있는 통성 혐기성균이다[3]. 대부분의 환경 속에 존재하고 있으며, B. cereus, B. thuringienses, B. anthracis, B. mycoides, B. pseudomycoides, B. toyonensis, 그리고 B. weihenstenstephanensis 의 총 7가지가 Bacillus cereus group에 속한다. B. cereus의 포자는 열처리에 사멸되지 않고 생존하는 특성을 지니므로 식품 및 식재료의 보관에 주의가 필요하다[4].
B. cereus의 독소형은 보유 독소 유전자에 따라 설사형(diarrheal type)과 구토형(emetic type)의 두 가지 type으로 구분된다. 설사형은 장독소(enterotoxin)에 의한 감염으로 증상은 감염 8-16시간 후에 설사, 복통, 일부 구토, 발열증상을 보인다[5]. 원인 독소 유전자로는 hemolysin BL(hblC), non-hemolytic enterotoxin(nheA), cytotoxin K(cytK), enterotoxin FM(entFM), bceT(Bacillus cereus toxin) 등이 있으며, 이 유전자들은 모두 PCR법에 의해 존재확인이 가능하다. 또한, 구토형은 cereulide라는 작은 펩타이드 단편에 의해 야기되며 증상으로는 감염 0.5-6시간 후에 구토, 일부 설사, 발열증상이 있다[6, 7]. 구토독소는 cereulide 형성과정에 관여하는 CER 유전자의 존재유무로 PCR법으로 확인할 수 있다[8].
현재 질병관리본부 수인성질환과의 진단 기준은 미국 CDC의 진단 기준을 바탕으로 작성된 “수인성식품매개질환 실험실 진단 실무 지침”에 준하여 검체(대변1g)에서 105의 B. cereus 균을 분리하거나 PCR 결과에서 하나 이상의 독소 유전자가 확인된 균주를 B. cereus로 동정하고 있다.
이 글에서는 2012-2015년도 급성설사질환 실험실 감시사업(EnterNet-Korea, 엔터넷)을 통해 국내 사람에서 분리된 B. cereus에 대한 분리현황과 독소유전자의 검출 패턴을 살펴보고자 하였다.


몸 말

1. 대상 균주
2012-2015년도 급성설사질환 실험실 감시사업을 통해 검사한 검체 건수는 70,406건으로 그 중 B. cereus 양성은 900건(1.3%)을 실험에 사용하였다.

2. 병원체의 배양
B. cereus는 mannitol egg yolk polymyxin(MYP) 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 혼탁한 환을 갖는 분홍색 집락을 선별하여 TSA에 계대한 후, API 50 CHB kit와 API 20E(BioMerieux) 를 이용하여 생화학적으로 동정하였다. 동정된 균을 영양배지인 TSA에 접종하여 37℃ 에서 24시간 배양 후 실험에 사용하였다.

3. B. cereus의 분리 현황
900균주 중 B. cereus의 월별 분리율을 살펴보면 6월부터 증가하여 8월까지 지속되었으며, 8월(2.3%)이 가장 높았고 다음으로 7월, 9월(1.9%) 순으로 나타낸 것으로 보아 기온이 높은 여름철에 증가하는 것을 알 수 있었다(Figure 1A). 연령별 분리율을 보면 60-69세에서 12.7%로 가장 많이 분리되었으며, 다음으로 70세 이상에서 9.1%로 나타낸 것으로 보아 높은 연령층에서 분리율이 높은 것을 확인하였다(Figure 1B).

4. 장독소 균주와 구토독소 균주의 비교
2012-2015년도 분리된 B. cereus 900주에서 장독소와 구토독소 유전자 검출 시험을 PCR법을 이용하여 시행하였고, 구토독소(CER)의 존재 유무에 따라 장독소만을 보유하는 장독소 균주(Enterotoxic strains)와 구토 독소와 장독소를 함께 보유하는 구토독소 균주(Emetic strains)로 분류하였다. 그 결과 총 900개의 균주에서 장독소 균주는 722주(80.2%), 구토독소 균주는 178주(19.8%) 였다(Table 1).
장독소 균주에서 독소 유전자 검출률은 entFM, nheA, cytK2, hblC 그리고 bceT 유전자가 각각 89.1, 82, 51.8, 45.8, 41.4%의 비율로 검출되었고, 구토독소 균주에서는 entFM, nheA, cytK2, hblC 그리고 bceT 유전자가 각각 78.7, 59.0, 14.6, 9.0, 11.2%의 비율로 검출되었다. 5개의 독소유전자 검출률은 구토독소 균주가 낮았으며, cytK2, hblC, bceT 유전자의 검출률은 현저하게 낮았다.

독소 유전자의 검출 형태에 따라 패턴을 분석한 결과 장독소 균주는 30개, 구토독소 균주는 20개의 패턴으로 분석되었다. 장독소 균주에서 가장 많은 패턴은 2개(entFM, nheA)의 장독소가 검출된 H패턴(21.6%)이었고, 다음으로 장독소 모두 검출된 A(20.1%)와 bceT가 제외된 4개의 장독소를 포함하는 B(11.2%)패턴의 순서로 높은 패턴을 보였다(Table 2). 다음으로 구토독소 균주는 2개의 장독소(entFM, nheA)를 갖고 있는 F패턴(44.4%)에서 가장 많았으며, 다음으로 entFM을 포함하는 N패턴(17.4%)과 CER 독소만을 포함하는 T패턴(15.2%) 순을 나타내었다(Table 3). 두 가지 독소 형태에서 모두 2개(entFM, nheA)의 독소가 포함된 패턴이 가장 많이 확인되었다.
2011년 브라질의 식품을 분석한 결과에 의하면 구토독소를 포함하지 않은 A패턴에 속하는 유형이 가장 많이 존재했다[9]. 또한 국내에서 식품, 임상 및 환경 샘플로부터 분석한 독소 유전자를 검출한 결과에서는 nheA, entFM 순으로 검출되는 패턴이 높게 나타났고[10], 이전에 보고된 결과들에서 국내 분리된 균과 해외에서 분리되거나 식품을 통해 유입되는 균에 대한 비교연구가 필요할 것으로 생각된다.


맺는 말

설사질환은 전 세계적으로 주요한 관심 중에 하나이다. Bacillus cereus는 자연계에 광범위하게 존재하며, 열악한 환경에서도 생존하는 능력을 가지고 있다. B. cereus에 의한 감염 증상은 심하지 않으며, 수 일 내에 자연 치유되는 경우가 많아, 병원에 내원하는 경우가 드물어 감염률에 비해 보고되지 않는 경우가 많을 것으로 예상된다. 더욱이 그람양성세균인 B. cereus는 병원성 대장균이나 세균성 이질균과 같은 그람 음성세균과 달리 다양한 독소를 가지고 있어, 인체 분리주에 대하여 6개 독소의 분포를 조사하고 주요 독소패턴을 파악하는 것이 중요하다.
본 연구에서는 급성설사질환 실험실 감시를 통해 전국 17개 시·도 보건환경연구원과 협력의료기관이 참여하여 2012-2015년 동안 설사질환 환자로부터 분리된 B. cereus의 독소 유전자의 패턴을 분석하였다. 5개 독소유전자의 검출률은 구토독소 균주에서 장독소 균주보다 낮았으며, 특히 cytK2, hblC, bceT 유전자의 검출률은 현저히 낮았다. entFM, nheA 유전자는 장독소 균주와 구토독소 균주에서 주요 독소유전자로 존재하고 있었다. 앞으로, 독소 패턴별 균주에 대해 역학 분석을 위해 전장 유전체 분석(WGS)이 필요하다고 판단된다.


참고문헌

1. Hong HA, Duc Le H & Cutting SM. 2005. The use of bacterial spore formers as probiotics. FEMS Microbiol Rev. 29:813-835.
2. Schoeni, J.L., Wong, A.C.L. 2005. Bacillus cereus food poisoning and its toxins. J Food Prot. 68:636-648.
3. Andersson A, Ronner U, Granum PE. 1995. What problems does the food industry have with the spore-forming pathogens Bacillus cereus and Clostridium perfringens?. Int J Food Microbiol. Dec;28(2):145-55.
4. Granum PE and Lund T. 1997. Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol Let. 157:223-228.
5. Lund, T., Debuyser, M.L., Granum, P.E. 2000. A new cytotoxin from Bacillus cereus that may cause necrotic enteritis. Mol Microbiol. 38:254-261.
6. Yang, I.C., Shih, D.Y., Huang, T.P., Huang, Y.P., Wang, J.Y., Pan, T.M. 2005. Establishment of a novel multiplex PCR assay and detection of toxigenic strains of the species in the Bacillus cereus group. J Food Prot. 68:2123-2130.
7. Guinebretiere, M.-H., Broussolle, V., Nguyen-The, C. 2002. Enterotoxigenic profiles of food-poisoning and food-borne Bacillus cereus strains. J Clin Microbiol. 40:3053-3056.
8. Kim JB, Kim JM, Kim CH, et al. 2010. Emetic toxin producing Bacillus cereus Korean isolates contain genes encoding diarrheal-related enterotoxins. Int J Food Microbiol. 15;144(1):182-6.
9. Chaves JQ, Pires ES, Vivoni AM. 2011. Genetic diversity, antimicrobial resistance and toxigenic profiles of Bacillus cereus isolated from food in Brazil over three decades. Int J Food Microbiol. 147:12-6.
10. Forghani F, Kim JB, Oh DH. 2014. Enterotoxigenic profiling of emetic toxin- and enterotoxin-producing Bacillus cereus, Isolated from food, environmental, and clinical samples by multiplex PCR. J Food Sci. 79(11):2288-93.