Abstract


Current development status of botulism therapeutics

Jeon Jun Ho, Chun Jeong-hoon, Choi Myung-Min, Rhie Gi-eun
Division of High-risk Pathogens, Center for Laboratory Control of Infectious Diseases, KCDC

Botulism is a serious disease caused by neurotoxins produced by Clostridium botulinum which is an anaerobic, Gram positive, spore-forming bacterium. The botulinum neurotoxin (BoNT) is one of the most toxic substances known to humankind, which causes muscle paralysis by inhibiting the release of neurotransmitter acetylcholine from motor nerves. There are seven types of BoNTs (classified A-G) designated as a Tier 1 Select Agent by the US Centers for Disease Control and Prevention (CDC) because of their high toxicity and ease of production. Clostridium botulinum and botulism are also respectively designated as high-risk pathogens and bioterrorism diseases according to the Korea Infectious Disease Control and Prevention Act. Presently, there are no effective BoNT therapeutics available against botulism except for equine antitoxins. Numerous efforts for the development of botulism therapeutics have been made over the past decade. In this report, we provide a summary of current development status of botulism antidotes against BoNTs reported to date. Specific inhibitors for the major steps involved in BoNT’s mechanism of action are discussed, including antitoxin antibodies, peptidic and non-peptidic small molecules, inhibitors against the endopeptidase activity. Although botulism therapeutic candidates currently possess limited effectiveness, sustained efforts are needed to develop more effective therapeutics against botulism through multidisciplinary approach.


  들어가는 말


보툴리눔 독소증(botulism)은 아포를 형성하는 절대혐기성의 그람양성세균인 Clostridium botulinum이 생산하는 신경마비독소인 보툴리눔 독소에 의하여 유발되는 질환으로, 보툴리눔 독소는 생체 내 신경전달물질인 아세틸콜린의 분비를 억제함으로써 근육 및 신경장애를 유발한다[1]. 이러한 보툴리눔 독소는 지구상에 존재하는 독소 중 가장 치명적인 것으로 알려져 있으며[1], 그 위험성으로 인해 우리나라의 ‘감염병의 예방 및 관리에 관한 법률’에서는 보툴리눔균 및 보툴리눔 독소증을 각각 고위험병원체와 생물테러감염병으로 지정하여 엄격히 관리하고 있다. 또한 보툴리눔균과 독소는 미국 질병관리본부(Centers for Disease Control and Prevention; CDC)에서 지정한 인간 위해도에 따른 분류 중 최상위 단계인 ‘Tier1 select agents and toxins’ 중 하나로 지정·관리되고 있다. 본 단신에서는 보툴리눔 독소증 치료제 개발 연구동향에 대하여 소개하고자 한다. 


  몸 말


보툴리눔 독소는 현재까지 A~G까지 7개의 독소형이 보고되고 있으며, 이 중 A, B, E와 F형이 사람에게 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다[2]. 보툴리눔 독소증은 감염형태에 따라서 식품매개 보툴리눔 독소증(Food-borne botulism), 영아 보툴리눔 독소증(Infant botulism), 상처 보툴리눔 독소증(Wound botulism), 의인성 보툴리눔 독소증(Iatrogenic botulism)과 흡인성 보툴리눔 독소증(Inhalation botulism) 등으로 나눌 수 있다[2](Figure 1). 식품매개 보툴리눔 독소증은 보툴리눔 독소가 포함된 음식을 섭취할 경우 유발될 수 있다[3]. 영아 보툴리눔 독소증은 성인에 비하여 장내 세균 총이 발달하지 못한 1세 미만의 영아에서 주로 발생하며, 음식을 통하여 섭취된 보툴리눔균 아포가 장관에 정착하여 생산한 독소를 흡수하여 유발된다[3]. 의인성 보툴리눔 독소증과 흡인성 보툴리눔 독소증은 자연적으로는 발생되지 않으며, 각각 의료관련 또는 생물테러와 같은 인위적인 행위에 의하여 유발될 수 있다[3]. 미국의 경우 2015년 199명의 보툴리눔 독소증 환자가 확진되었다. 이중 영아 보툴리눔 독소증의 발생 빈도가 가장 높아 141건(71%) 발생되었으며, 식품매개 보툴리눔 독소증 39건(20%), 상처 보툴리눔 독소증 15건(8%), 그리고 원인을 알 수 없는 경우가 4건(2%) 보고되었다[4]. 우리나라의 경우에도 2003년과 2004년, 그리고 2014년에 보툴리눔 독소증 환자가 확인된 경우가 있다.
보툴리눔 독소는 신경세포로의 부착 및 독소의 운반에 관여하는 100 kDa의 중쇄(heavy chain)와 아연-의존성 내부 단백분해효소(zinc-dependent endopeptidase) 기능을 하는 50 kDa의 경쇄(light chain)로 구성된다[3]. 보툴리눔 독소는 먼저 150 kDa의 활성이 없는 단일펩타이드 사슬로 생성된 후 단백질분해효소에 의해 분리된 중쇄(100 kDa)와 경쇄(50 kDa)가 이황화결합으로 연결된 활성화 상태가 된다[3]. 활성화된 독소는 신경세포의 polysialogangliosides와 synaptic vesicle(SV) 단백질(SV2 또는 synaptogamin) 등과 결합(중쇄의 C-말단 수용체 결합 도메인 관여)한 후 세포내 함입(endocytosis)에 의하여 세포내로 들어가게 되는데 이 때 보툴리눔 독소 중쇄의 N-말단 전위 도메인(translocation domain)이 관여하는 것으로 알려져 있다[3]. 세포 내부로 들어간 독소의 경쇄는 단백분해효소로 작용하여 신경전달물질의 분비에 관련된 SNARE 복합체(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors complex)를 분해하여 아세틸콜린의 분비를 억제함으로써 신경마비를 유발한다[3]. 보툴리눔 독소 A, C, E는 SNARE 단백질 중 SNAP-25를 분해하며, 보툴리눔 독소 B, D, F, G는 synaptobrevin을 분해한다[1, 5] (Figure 2). 이와 더불어, 보툴리눔 독소 C의 경우는 SNAP-25와 함께 syntaxin도 분해한다[1, 5]. 현재 보툴리눔 독소증 치료를 위해서는 독소 A, B, E와 A, B, C, D, E, F, G에 대한 마항독소가 미국 FDA의 승인을 받아 사용되고 있으며, 영아 보툴리눔 독소증 치료를 위해서는 5가지 독소(A, B, C, D, E)의 톡소이드 백신을 접종받은 사람의 혈액에서 정제한 IgG인 BabyBIG이 사용되고 있다[2].

항체 기반 보툴리눔 독소증 치료제

앞서 설명한 바와 같이 보툴리눔 독소증 치료를 위해서 마항독소와 BabyBIG이 현재 사용되고 있으나 마항독소는 이종 항체이며, 두 항체 모두 다클론항체이므로 안전성의 확보가 필요하다. 단클론항체는 다클론항체에 비하여 생산 배치에 따른 변화가 적으며, 감염 위험이 없는 장점을 가지고 있다[2]. 따라서 최근 보툴리눔 독소증 치료용 단클론항체의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 하지만 현재까지 단일 항체는 보툴리눔 독소증에 확실한 치료 효과를 보이는 항체가 보고된 바 없으며, 몇 가지 항체를 혼합하여 연구가 진행되고 있다. 현재 미국 Xoma사와 NIAID(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)가 협력하여 보툴리눔 독소 A, B, E에 대한 치료용 항체를 개발하였으며, 미국 FDA의 승인을 위하여 연구를 진행하고 있다[6]. 이와 함께 독소형 C, D, F, G에 치료용 항체개발 연구가 진행 중에 있다[2]. 또한 최근 낙타, 라마 등에서 생산 가능하며, 상대적으로 크기(15~20 kDa)가 작아 표적 항원 및 조직 등으로의 접근이 용이한 단일 도메인 항체를 이용한 치료제 연구가 보툴리눔 독소 A를 중심으로 진행되고 있다[1, 2].

펩타이드성 저분자(peptidic small molecules) 저해제


펩타이드를 이용한 보툴리눔 독소 저해제 연구는 주로 보툴리눔 독소 경쇄와 결합하여 단백질분해능을 억제하는 저해제들이 보고되었다. 2-mercapto-3-phenylpropionly-RATKMAL과 CRATKLM, 그리고 Q-RATKM 등이 보툴리눔 독소 A 경쇄의 단백질 분해능을 억제할 수 있음이 알려졌다[2]. 또한 RRGC, RRLG, RRGI와 RRGM의 4가지 펩타이드가 낮은 농도(Ki 157~845 nM)로 보툴리눔 독소 A의 경쇄 활성을 억제할 수 있음이 보고되었다[5]. 하지만 펩타이드 기반 저해제는 낮은 생체 이용률과 낮은 지속성을 나타내는 것으로 알려져 있어 이를 보완할 수 있는 저해제 발굴 연구가 진행되고 있다[2].

비펩타이드성 저분자 (non-peptidic small molecules) 보툴리눔 독소 저해제


비펩타이드성 저분자 저해제는 안정성과 막투과성이 높기 때문에 보툴리눔 독소를 보유하는 신경세포와 같은 표적세포로의 이동이 용이한 장점을 가지고 있다. 이러한 저해제에는 보툴리눔 독소 세포 결합 억제제, 보툴리눔 독소의 세포내 이동 및 K+채널 억제제 그리고 보툴리눔 독소의 세포질 내 활성 억제제로 나눌 수 있다[2]. 먼저 세포 결합 억제제로는 민달팽이 종류인 Limax flavus와 밀 종류인 Triticum vulgaris로부터 분리한 랙틴(lectin)이 있다[2]. 랙틴은 세포막의 sialic acid와 결합하여 다양한 독소형의 보툴리눔 독소의 기능을 억제할 수 있는 것으로 알려져 있다[2]. 또한 항암제로 사용되는 doxorubincin은 보툴리눔 독소 B의 수용체 결합 도메인과 결합하여 독소와 신경세포와의 결합을 억제하는 효과가 있음이 보고되었다[2]. 보툴리눔 독소의 세포내 함입 및 이동을 막는 저해제 중 ammonium chloride, methylamine hydrochloride, aminoquinolines, nigericin, monensin 등은 세포 내 endosome의 acidification을 저해함으로써 보툴리눔 독소의 활성을 억제한다[2, 5]. 또한 bafilomycin A1은 H+-ATPase pump의 산화환원 전위를 방해함으로써 독소의 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다[2]. 식물의 트리테르페노이드(triterpenoid)의 일종인 toosendanin은 보툴리눔 독소 경쇄의 세포내 이동을 억제하는 것으로 보고되었으며[2, 7], 원숭이 모델에서 보툴리눔 독소 A, B, E에 의한 원숭이의 치사율을 억제할 수 있음이 보고되었다[2]. Potassium 채널 억제제인 3,4-DAP(diaminopyridine)은 보툴리눔 독소의 작용을 저해할 수 있음이 알려졌다[2, 5]. 보툴리눔 독소의 주요 작용기전인 세포질 내 endopeptidase 활성 억제는 보툴리눔 독소의 SNARE 단백질 분해 활성을 직접적으로 억제할 수 있다는 측면에서 의미가 있다. 비펩타이성 저분자 라이브러리 스크리닝을 통하여 quinolinol 계열의 CB 7969312와 NSC 84087 그리고 곰팡이류 대사물질인 chaetochromin A와 talaroderxines A가 보툴리눔 독소 A의 단백질분해 활성을 저해할 수 있음이 보고되었다[2, 5]. 또한 ICD 1578(7-N -phenylcarbamoylamino-4-chloro-3-propyloxyisocoumarin)와 BABIM(Bis(5-amidino-2-benzi -midazolyl) methane)은 보툴리눔 독소 B의 단백질 분해 활성을 저해할 수 있음이 보고되었다[2].
압타머(Aptamers)

압타머는 표적 분자 또는 단백질과 높은 친화성과 특이적 결합능력을 가진 단일가닥 올리고뉴클레오타이드(DNA, RNA, 변형핵산)를 말한다. 압타머는 1990년 콜로라도대학 연구팀에 의하여 SELEX(systemic evolution of ligands by exponential enrichment) 기술이 개발된 이후 다양한 표적분자와 결합하는 압타머에 대한 발굴(Figure 3) 및 이를 이용한 연구가 진행되고 있으며, 높은 결합력과 특이성으로 인하여 특정 표적물질의 탐지 및 특정 단백질의 기능을 억제하는 중요한 도구로 현재 이용되고 있다[2, 8]. 치료제로서의 압타머는 여러 가지 장점을 가지고 있는데, 먼저 높은 안정성을 보이며, 항체와 필적할 정도로 표적단백질과 높은 친화도와 특이도를 나타내며, 변형, 보관 및 제형이 용이한 특징을 갖는다[2]. 또한 현재 많은 질병에서 사용되고 있는 항체와 비교했을 때에도 몇 가지 장점을 가지고 있다[2, 8]. 첫째, 압타머는 생체 내에서 독성이 낮으며, 항체와 달리 면역반응을 유도하지 않는 것으로 알려져 있다. 둘째, 압타머는 항체(∼150 kDa)에 비해 상대적으로 분자구조(∼10 kDa; 약 20～60 mer)가 작기 때문에 높은 조직 투과성을 보인다. 셋째, 압타머는 화학합성이 가능하기 때문에 변형이 용이하며, 상대적으로 비용이 저렴하고, 생산시기에 따른 기능성 변화가 적다. 넷째로는 보툴리눔 독소와 같이 독성으로 인하여 항체를 만들기 어려운 경우에도 적용이 가능하다. 보툴리눔 독소를 이용한 압타머 연구는 주로 독소 A를 이용하였으며, 독소 A의 경쇄에 특이적인 RNA 압타머를 SELEX를 통해 발굴하였다. 이들 압타머는 보툴리눔 독소의 단백질 분해 능력을 효과적으로 저해할 수 있음이 알려졌다[2, 8].


  맺는 말

앞서 설명한 바와 같이 보툴리눔 독소증 치료제 개발을 위하여 항체 치료제, 펩타이드 및 비펩타이드성 저분자 저해제, 압타머 등 다양한 치료제 후보들에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한 보툴리눔 독소증 치료제 개발은 미국 NIAID(National Institute of Allergy and Infectious Diseases)의 최우선 과제 중 하나로 선정되어 진행되고 있다. 하지만 현재까지 발굴된 저해제 및 항체 치료제 후보는 제한적인 치료효과, 안정성의 문제, 낮은 세포투과성 및 생체 이용률, 독성 등으로 인하여 부분적인 성공을 거두고 있다. 따라서 이를 보완할 수 있는 효과적인 보툴리눔 독소증 치료제 발굴 연구가 진행되어야 할 것이다. 보툴리눔 독소는 미용 및 의료 목적으로 현재 사용되고 있지만, 현재까지 알려진 독소 중 독성이 가장 높으며, 생물테러 시 극미량으로도 인체에 치명적인 효과를 유발하고, 생물테러에 사용될 가능성이 높은 물질 중 하나이므로 철저한 대비가 필요하다. 따라서 보툴리눔 독소의 신속한 진단·탐지 및 예방을 위한 백신 연구와 더불어 치료제 개발에 대한 지속적인 투자와 연구를 통하여 국가 생물테러 대비·대응 능력을 강화해 나가야 할 것이다.


  참고문헌


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4. http://www.cdc.gov/botulism/surveillance.html. National Botulism Surveillance Summary 2015.
5. Kiris E, Burnett JC, Kane CD, Bavari S. Recent Advances in Botulinum Neurotoxin Inhibitor Development. Curr Top Med Chem 2014; 14: 2044-61.
6. Nayak SU, Griffiss JM, McKenzie R, Fuchsss EJ, Jurao RA, An AT, Ahene A, Tomic M, Hendrix CW, Zenilman JM. Safety and Pharmacokinetics of XOMA 3AB, a Novel Mixture of Three Monoclonal Antibodies against Botulinum Toxin A. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58: 5047-53.
7. Li MF, Shi YL. Toosendanin interferes with pore formation of botulinum toxin type A in PC12 cell membrane. Acta Pharmacol Sin 2005; 27: 66-70.
8. Chang TW, Blank M, Janardhanan P, Singh BR, Mello C, Blind M, Cai S. In vitro selection of RNA aptamers that inhibit the activity of type A botulinum neurotoxin. Biochem Biophys Res Commun 2010; 396: 854-60.