Abstract

Introduction of reference materials for water- and food-borne disease viruses


Jung Sunyoung, Lee Deog-Yong, Choi Wooyoung, Kang Chun
Division of Viral Diseases, Center for Laboratory Control of Infectious Diseases, KCDC
Park Ye Eun
Division of Laboratory Diagnosis Management, Center for Laboratory Control of Infectious Diseases, KCDC

Positive controls are crucial to ascertain the reliability of results in diagnosis and experiments. Therefore, we have produced reference material according to international regulation and have used it as a positive control. In this article, we introduce the reference material for detection of water- and food-borne disease viruses. ISO guideline 34/35 is the international standard for reference material, which has the management-related, technical requirements for producing such materials. Reference material of norovirus, which is the representative water- and food-borne pathogen, has been produced globally. However, it remains valid only for a short duration after production and shows mismatches in amplification region. In Korea, some reference materials have been produced and are being used as internal controls without following the international guidelines. Therefore, the Korea Center for Disease Control and Prevention (KCDC) started to produce the reference material for water- and food-borne disease viruses based on the international standard, ISO guideline 34/35. The process of production was as follows: selection of the target region, RNA synthesis, measurement of concentration, contamination, homogeneity, and stability. First, we selected norovirus and subsequently have expanded to other food-borne disease viruses. Now, KCDC provides 6 type of reference materials to be used as positive control materials for diagnosis of viruses that cause water- and food-borne diseases. To improve the reference material produced, the standard materials obtained should be improved continuously and be used as positive controls for achieving the reliable experimental results.

Keywords: Reference Materials, Water and food-borne disease, Reliability, Diagnosis, Norovirus


들어가는 말


질병관리본부에서는 전국 시·도 보건환경연구원과 함께 바이러스성 장염에 대한 전국적인 실험실 감시망을 운영하고 있다. 바이러스성 장염은 주로 소아에서 급성으로 발현하는 질환으로서 노로바이러스(Norovirus) 외 그룹 A형 로타바이러스(Group A Rotavirus), 장 아데노바이러스(Enteric adenovirus), 아스트로바이러스(Astrovirus), 사포바이러스(Sapovirus)가 주요 원인 병원체이다. 매년 표본 감시 사업을 통해 2만 여건의 검체에 대한 검사가 이루어지고 있으며, 양성 검체에 대한 유전자 특성 분석도 함께 이루어지고 있다. 신속한 실험실 검사와 자료 분석을 통하여 실시간으로 결과가 환류 되어야 하므로, 이를 위해 검사 시간의 단축과 특이도를 높이기 위해 유전자 검사법인 PCR이 보편적으로 사용되고 있다. 특히, 실험 결과의 확실성을 위해 양성대조물질(실험 결과에 항상 활성을 가지는 것)과 음성대조물질(결과에 항상 비활성을 가지는 것)을 기본적으로 사용하고 있다. 양성대조물질은 병원체 검사의 정확성, 정밀성 그리고 재현성에 대한 보장을 위해 반드시 필요한 물질이다. 병원체 검사에 대한 향상된 질 관리와 결과 값에 대한 객관성을 높이기 위해 장염 바이러스에 대한 국내·외 표준물질을 조사하였다. 하지만 국내에서 범용으로 사용할 수 있으면서 국제기준에 부합하는 인증 표준물질(Certified Reference Material, CRM)은 확보할 수 없었다. 이 글을 통해 양성대조물질에 대한 개념과 국제적인 기준을 정리하고 이에 준하는 장염바이러스 표준물질 생산을 위해 질병관리본부에서 수행하였던 결과를 소개하고자 한다.


몸 말


2000년도 초반 국제적인 무역환경의 변화에 따라 시험의 소급성, 정확도 그리고 정밀도 등에 대한 요구가 증대되었고, 시험의 중요 요소 중 하나인 측정 소급성에 대한 인식전환이 이루어지면서 국제공인시험기관의 기능이 급격히 확대되었다. 특히, 국제표준화기구 표준물질위원회(ISO Committee on Reference Materials, ISO/REMCO)에서는 국제표준물질 데이터베이스(Code d’Indexation des Matriaux de Rfrence, COMAR)에 각국이 개발한 표준물질들을 등록하고 사용하도록 권고하고 있다. 이곳에 등록된 표준물질들은 규정된 요건에 따라 물질의 생산, 관리 및 통계적 분석을 수행하여 인증 절차를 따르기를 요구하고 있으며, 표준물질은 ISO guideline 34/35에 따라 생산 및 관리하도록 되어있다. ISO guideline 34/35에는 표준물질 생산을 위한 경영 요구사항과 기술 및 생산 요구사항에 대해 자세히 언급 되어있다. 경영 요구사항에는 조직 및 경영, 위탁기관의 활용, 고객서비스 및 물품구매, 계약, 부적합 물질의 관리, 시정 및 예방 조치, 경영 검토 등이 해당된다. 기술 및 생산 요구사항에는 물질을 직접 생산하는데 관련된 인력, 시설 및 환경, 측정 장비, 물질제조, 특성 값 및 불확도 부여, 균질성 및 안정성 평가, 측정소급성 확보 등이 해당된다[1, 2]. 국제표준기준의 정의에 따르면 표준물질(Reference Material, RM)이란 측정기기의 교정, 측정방법의 평가 또는 재료에 값을 부여하는 것에 사용하기 위해 하나 이상의 특성 값이 충분히 균일하고 적절하게 확정되어 있는 재료 또는 물질이라고 정의되어있다. 이러한 표준물질에 특성 값을 나타내는 단위의 정확한 표현과 이 단위에 근거하여 소급성이 확립된 절차에 따라 하나 이상의 특성 값이 인증되며, 각 인증 값에 정해진 신뢰수준에서의 불확도가 확보된 인증서가 수반되면 이 물질을 인증 표준물질(Certified Reference Material, CRM)이라고 부른다(Figure 1)[1, 2].
국제표준물질 데이터베이스에 현재까지 등록된 생물학분야의 인증물질은 전체의 3.0%정도를 차지하고 있다(Figure 2)[3]. 장염을 유발하는 병원체중 노로바이러스는 전 세계적으로 가장 높은 유병률을 보이는 병원체로써 우리나라에서도 질병 관리본부와 여러 부처의 검사기관에서 검사를 수행하고 있다. 노로바이러스 표준물질은 영국의 NIBSC(National Institute for Biological Standards and Control, 국립생물표준통제연구원)와 미국의 ATCC(American Type Culture Collection, The Global Bioresource Center, 미국의 생물자원 보관 및 분양 등을 하는 기관)에서 제조하는 것으로 알려져 있으나 일상적인 진단용으로 사용하기에는 가격이 비싸고, 국내에서는 수입해서 사용해야 하며 유효기간이 약 1개월여 밖에 되지 않는다는 제한점이 있다. 또한 우리나라에서 유전자 진단 및 감시사업을 위해 사용하고 있는 유전자 부위와 시판되고 있는 인증표준물질의 부위가 달라서 국내에서 범용으로 사용하는데 한계가 있다(Figure 3)[4]. 국내에서는 식품의약품안전처와 국립환경과학원에서 tran RNA를 이용한 표준물질을 합성하여 사용하고 있다[5]. 그러나 국제기준에 따라 생산 및 관리되는 물질이 아니며 내부 양성대조물질의 수준에만 머물러 있다. 또한 노로바이러스 외 수인성 식품매개 바이러스인 그룹 A형 로타바이러스, 장아데노바이러스, 아스트로바이러스, 사포바이러스와 A형 간염바이러스도 국제적인 표준물질이 존재하지 않거나 내부 양성대조물질용으로 생산 및 사용하고 있는 등 노로바이러스와 비슷한 한계점을 가지고 있다.
질병관리본부에서는 이러한 한계점을 극복하고 국내에서 범용으로 사용할 수 있는 표준물질을 생산하고자 하였다. 국제규격기준인 ISO guideline 34/35에 맞는 표준물질 생산시스템을 구축하기 위해 우선 노로바이러스 1종을 대상으로 생산을 시작했다. 노로바이러스 감염을 확인하기 위해서는 먼저 실시간 유전자 증폭법(Real-time RT-PCR)을 이용하여 바이러스의 감염여부를 확인한 후, 일반 유전자 증폭법(Conventional RT-PCR)을 통해 증폭된 유전자의 염기서열을 확인하여 유전형을 확인하는 과정을 거친다. 두 시험법에서 증폭하고자 하는 유전자의 부위가 다르고, 기관 또는 연구자별로 사용하는 프라이머(Primer)의 위치가 달라 기존의 표준물질 사용의 한계가 있었던 점을 고려하여 이 부분을 모두 포함하는 표준물질을 제작하고자 하였다.
노로바이러스 표준물질을 생산하기 위해 인체 감염을 일으키는 유전자 그룹인 Group I 과 Group Ⅱ 에서 가장 높은 유병률을 보이는 두 유전형(GI.4, GⅡ.4)을 선별하고 다른 유전형과 상호 비교하여 유전자의 대표성을 확인하였다. 두 유전형에 대한 염기서열을 바탕으로 주형 DNA를 합성하고, 이를 이용하여 합성 RNA를 만드는 공정을 시작하였다. 대상 유전자 선별, RNA 합성, 생산된 RNA의 특성 값, 오염 여부, 균질성 및 안정성 확인의 과정을 거쳐 최종 사용 단계의 합성 RNA를 생산하였다. 생산된 표준물질은 실시간 유전자 증폭법(Real-time RT-PCR)과 일반 유전자 증폭법(Conventional RT-PCR)에 의해 모두 증폭됨을 확인하였다. 두 시험법에 의해 충실히 유전자가 증폭될 수 있는 농도(2 x 104 copies/㎕)를 최종 농도로 설정하고, 측정 불확도를 산출하여 최종 특성 값을 정하였다. 단기안정성과 장기안정성 검사를 통해 실온에서는 3일, -20℃에서는 한달, -70℃에서는 1년까지 합성된 RNA가 안정되게 보관됨을 확인하였다. 각 단계에 대한 생산 공정서를 작성하여 생산과정의 재현성을 확보하고 생산 시스템에 대한 표준화를 구축하였다(Figure 4).
구축된 생산시스템을 바탕으로 병원체를 확대하여 생산하였다. 대상 병원체는 국내 집단 환자 발생이 많고, 유전자 검사가 주요 진단법인 수인성 식품매개 바이러스 6종으로, 급성위장관염을 일으키는 5종의 장염바이러스(노로바이러스, 그룹 A형 로타바이러스, 장아데노바이러스, 아스트로바이러스, 사포바이러스)와 급성간염을 일으키는 A형 간염바이러스가 이에 해당한다. 장아데노바이러스를 제외한 5종의 바이러스가 RNA를 핵산으로 갖고 있어, 다양한 종류를 동시 생산하면서 발생할 수 있는 오염 문제를 배제하기 위해 생산 단계별로 순차적으로 생산하는 시스템을 추가로 도입하였다. 생산된 표준물질의 품질확인을 위해 공동시험분석을 시행하였다. 또한 생산된 표준물질의 한계점으로 안정성이 지적되어 그것을 보완하기 위해 RNAase inhibitor를 사용하여 일반 저온냉동고(-20℃)에서도 3개월까지 보관이 가능하도록 개선하였다. 표준물질의 불활화로 인해 발생할 수 있는 결과의 오차를 최소화하기 위해 포장용기 개봉 후 1회 사용할 것을 권장하며 나머지는 폐기하는 것을 사용매뉴얼의 원칙으로 하였다. 1회성을 강조하고 재사용 방지를 위해 각 포장 용기 당 담겨있는 표준물질의 양을 40 ㎕에서 20 ㎕로 줄이고 적절한 농도의 RNAase inhibitor를 사용하였다. 또한 초저온(-70℃)에서 동결 상태로 장기간 보관 시 증발되는 현상을 막기 위해 보관 용기를 PCR tube에서 Screw-cap 방식으로 교체하고, 1차 동결 후 cap을 재 봉인하는 과정을 생산 공정에 추가하여 증발현상을 최소화 하였다.
현재 생산된 수인성 식품매개 바이러스 표준물질은 식품 의약품안전처 등 장염바이러스 진단 업무를 수행하고 있는 국가기관 및 각 시·도의 보건환경연구원, 국방부 산하 국군의학연구소, 지자체 상하수도연구소까지 무상으로 배포하여 검사업무 수행 시 검사의 객관성 확보를 위한 양성대조 물질로 사용하고 있다. 또한 보건검사기관의 정도 평가 및 장비의 검·교정을 위한 표준물질로도 활용하고 있다. 또한 생산된 표준물질의 일부는 일반 연구자와 민간기관에서도 활용할 수 있도록 국가병원체자원은행에 기탁하기도 하였다.


맺는 말


지속적인 개선을 통해 수인성식품매개바이러스에 대한 표준물질은 세계적인 수준의 표준물질로서 자리를 잡아가고 있지만 여전히 해결해야 하는 한계점들이 있다. 첫째, 생물분야 표준물질이 공통적으로 안고 있는 문제점으로서 SI unit(International System of Unit)의 부재이다. 특성 값을 표현하기 위해서 국제적으로 공인된 SI unit이 필요하지만, 생물분야에서 대부분 적절한 SI unit이 없는 실정이다. 현재는 합성 RNA의 물질 내 농도를 계산하여 특성 값으로 사용하고 있다. 둘째, 생산한 물질의 소급성 확보를 위한 신뢰성 있는 대조물질이 없는 점이다. 이를 보완하기 위해 질병관리본부에서는 자체적으로 개발한 검사법을 이용하여 cloned plasmid를 대조물질로 사용하여 상대 정량을 수행하고 있다. 마지막으로 합성 RNA의 안정성이다. 장기간 보관 시 초저온냉동고 (-70℃)에 보관해야 하므로 장비를 갖추고 있지 않은 기관에서는 물질보관에 한계가 있다.
검사 및 진단업무에서 신뢰성 있는 양성대조 물질의 사용은 결과의 객관성 확보를 위해 필수적인 요소이다. 질병관리본부에서는 수인성 식품매개 바이러스에 대한 유전자 검사를 위해 국제기준에 따라 생산 시스템을 구축하여 명실상부한 국제 수준의 표준물질을 생산하고 있다. 표준물질의 안정성 및 활용성 제고를 위해 동결제형의 개발 등 아직 해결되지 않은 문제점을 극복하여 양질의 표준물질 확보를 위한 지속적인 노력이 필요하다.


참고 문헌


1. KSA ISO guideline 34.
2. KSA ISO guideline 35.
3. http://www.comar.bam.de/en
4. 질병관리본부 국립보건연구원. 수인성식품매개질환 실험실 진단 실무 지침. 2015. 11-1352159-000371-14(발간등록번호).
5. Lee SG, Lee SH, Park SW, Suh CI, Jheong WH, Oh S, Paik SY. Standardized positive controls for detection of norovirus by reverse tranion PCR. Virol. J. 2011;26(8):260. doi: 10.1186/1743-422X-8-260.